郝浩浩 李 翔 郭传滨 吴俊林 唐培培 赵佳佳 孙会忠
（1河南省烟草公司驻马店市公司，河南驻马店 463000；
2河南科技大学农学院，河南洛阳 471000）
络石（T.jasminoides）属夹竹桃科络石属，是一种传统中草药植物，有抑菌、抗痛风之效，临床多用于治疗坐骨神经、关节炎、喉痹咽塞、喘息不通、咳嗽喘息、腹泻等症[1]。除具有药理作用外，络石也是常见的园林观赏植物。很多药用植物因受到其生长环境的地域差异和自身发育生物学等因素的影响，人们对其研究和开发利用不够深入[2]。从植物内生细菌微生物资源中寻找功能菌已成为生物资源开发的热点方向。一些从药用植物中分离出的特定内生菌在与宿主植物长期协同进化的过程中，往往能产生与其相同或相似的生物活性物质，从而表现出特定的功能活性，这是植物内生菌资源包括生防菌开发研究的理论依据之一[3]。许多药用植物的内生菌不但能促进植物自身的生长发育，内生菌抑菌活性也可广泛应用于中药植物栽培中的生物防治[4-5]。另外，一些药用植物中分离出的内生细菌产生的活性成分对肿瘤细胞的生长也有抑制作用，表现出抗肿瘤作用[6-8]。因此，从传统中药植物中分离筛选特色功能菌资源具有重要的现实意义。
烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，全国各植烟区均有发生，对烟草生产造成了很大的损失。烟草绿色生产的客观需求，使得生物防治成为普遍重视的研究热点之一[9]。为此，本研究以野生络石为试验材料，对内生细菌进行分离培养，筛选鉴定具有显著抑菌活性的微生物资源，并通过盆栽试验验证内生细菌的应用效果。
1.1 材料
2021年7月，笔者于洛阳市天池山采集野生络石完整植株作为试验材料。指示病原真菌：烟草黑胫病原（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）由洛阳农林科学院刘顺通研究员惠赠。
1.2 培养基
NA固体培养基：内生细菌的分离和培养及拮抗试验用。PDA培养基：病原真菌的培养及拮抗试验用。LB液体培养基：生防菌菌悬液制备用。所有培养基在120℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min备用。
1.3 内生细菌的分离和纯化
将络石流水冲洗20 min后，用75%乙醇浸泡2 min，无菌水漂洗3次，再用0.1%升汞二次浸泡消毒2 min，无菌水漂洗3次（取最后1次无菌水漂洗液涂板，无菌生长作为是否消毒彻底的依据）。将消毒后的植株放入无菌研钵中5 mL无菌水研磨成浆，静置5 min，用移液枪吸取60μL上清液，涂布NA平板中，28℃培养2～3 d。挑取典型菌落进行划线纯化。
1.4 内生菌抑菌活性筛选
1.4.1菌悬液的制备。将纯化的内生细菌接入100 mL的LB液体培养基中，32℃、200 r/min条件下培养24 h。取适量菌液于灭菌离心管中，12 000 r/min离心15 min，收集菌体，用无菌水悬浮并调整浓度至1.0×108CFU/mL，获得菌株菌悬液[10]。
1.4.2 平板对峙实验。采用牛津杯平板对峙法[11]，分别考察分离内生细菌对指示病原真菌黑曲霉的拮抗作用。在PDA平板中央接入黑曲霉菌饼，距菌饼3 cm处左右对称放置2个牛津杯，且每个牛津杯加注20μL制备好的内生细菌菌悬液，以牛津杯注入无菌水为作为对照，做3次重复，然后置于28℃的培养箱中连续培养5～7 d，定期观察生长情况。
1.5 菌株的多相分类鉴定
1.5.1 形态学观察及生理生化特征测定。将测定菌株接种于LB固体培养基培养48 h，制样进行光镜和扫描电镜下的形态观察[12]。生理生化指标的测定方法参考文献[13-14]，测定方法参考文献进行。
1.5.2 菌株16S rDNA分析。将测定菌株接种于LB固体培养基过夜摇床培养，采用试剂盒提取基因组DNA；
选用通用引物：27F（5"-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3"），1492R（5"-GGTTACCTTGTTACGACTT-3"）。PCR体系及操作方法参考文献进行。测序结果提交NCBI进行比对，并采用MEGA7的Neighbor-Joining法构建系统发育树[15]。
1.6 目标菌抑菌作用应用试测实验
测试植株的制备：用PDA培养基培养烟草黑胫病病原，并制备孢子悬液（血球计数板检测孢子数目，调整孢子浓度至1.0×105CFU/L）。侵染方法：取1 mL孢子悬浮液于接种到植株根部，以无菌水处理为对照。26℃恒温培养箱培养，光周期12 h黑暗交替。
将测试菌株用LB液体培养基32℃摇床培养至OD=4，然后12 000 r/min离心15 min收集菌体，再用等量无菌水悬浮菌体制得测试母液。施用方法：喷雾法（叶片完全湿润为标准）和灌根法（土表沿茎基部浇注5 mL）。施用时间：病原侵染2 d后。每处理3次重复，以无菌水处理作为对照，7 d后进行叶片病情指数及发病率的调查。
1.7 统计分析
烟草黑胫病调查分级标准：0级，全株无病；
1级，茎部病斑超过茎围的1/2，或半数以下叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；
2级，茎部病斑超过茎围的1/2，或半数以上叶片凋萎；
3级，茎部病斑环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎；
4级，病株全部叶片凋萎或枯死。
病情指数＝（∑各级病株或叶数×该病级值）/（调查总株或叶数×最高级值）×100；
防治效果（%）＝（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100
2.1 络石内生细菌分离结果
络石营养体混合样研磨涂布NA平板中，28℃培养2～3 d以后，平板上形成特征典型的菌落（图1）。挑取菌落进行3次划线纯化，共获得31株细菌活体纯培养物，依次编号为HHH12～HHH31。15%甘油于-20℃保种备用。
图1 络石内生菌分离平板生长情况
2.2 络石内生细菌生防活性菌株筛选结果
以烟草黑胫病原为指示菌，分别对获得的31株络石内生细菌的拮抗活性进行考察。对峙试验结果表明，HHH12菌株对烟草黑胫病；
病原菌丝具有明显的抑制作用（图2），抑菌圈直径达到24 mm，初步将其定性为具有生防活性功能菌株。
图2 菌株形成的抑菌圈
2.3 菌株HHH12的分类鉴定结果
将菌株HHH12在LB培养基培养后观察可见，菌落呈黄色，不透明，边缘整齐，隆起明显，表面湿润（图3-A）。革兰氏染色阴性，菌体呈直杆形，多单生，两端钝圆，具端鞭毛，长介于2.3～3.6μm，直径介于1.1～1.5μm（图3-A，B）。
图3 菌株HHH12的形态特征
菌株HHH12的生理生化指标测定结果：测定结果呈阳性反应的项目包括明胶水解试验试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、接触酶试验、脲酶水解试验和吲哚试验；
阴性反应项目包括淀粉水解、甲基红试验、糖类发酵试验。
菌株HHH12的16S rDNA序列分析结果：菌株HHH12的16S rDNA基因扩增产物测序结果为1 503 bp，序列提交GenBank获得登录号OL966065。在GenBank比对获得同源性较高序列并构建进化树（图4）。结果表明，菌株HHH12与Pseudomonas fluorescens（LS483372.1）、P.fluorescens（MT712234.1）和P.fluorescens（NR114476.1）聚为一支，相似度达到98%。结合菌株LZ-7的形态、生理生化和分子鉴定结果，将其鉴定为假单孢菌属菌株，暂命名为Pseudomonassp.HHH12。
图4 菌株HHH12的系统发育树
2.4 菌株HHH12的生防应用效果
通过盆栽试验，考察菌株HHH12对烟草黑斑病的生物防治效果，试验结果见表1。由表1可知，HHH12菌悬液的灌根、叶面喷雾和灌根+叶面喷雾3种处理表现出不同的生防效果，整体而言，灌根+叶面喷雾混合处理在不同发病阶段均表现出比叶面喷雾和灌根单一处理有更好的应用效果，施药后14 d时的防治效果达到72.86%，是灌根处理的1.09倍，是叶面喷雾处理的2.94倍。叶面喷雾和灌根相比较而言，后者优于前者，14 d时的灌根处理的防治效果是叶面喷雾的2.71倍。3种施用方法的防治效果相互之间差异达显著水平。验证结果进一步证实，HHH12菌株对烟草黑胫病的防治是有效的。可见，单一灌根和灌根+叶面喷雾均具有较好的生防效果，单一叶面喷雾效果较差，不建议使用。
表1 菌株HHH12对花叶络石叶斑病的防治效果（平均值±标准误）
植物内生菌是筛选功能微生物的一个重要来源。本研究采用NA培养基从野生络石营养体中分离得到31株内生细菌活体纯培养物，说明野生络石植株体内生细菌资源多样性丰富。如果不断优化和改变分离培养基类型，分离到更多种类的内生菌是可能的。
络石作为一种传统中草药植物，其核心功效是抑菌、抗痛。依据自然界生物的协同进化原理和规律[16]，从络石营养体内筛选出具有抑菌作用的生防菌也是可能的。本研究开展的31株菌株对烟草黑胫病原的对峙试验证实了这一推测，其中菌株HHH12的平板对峙抑菌圈直径达到24 mm，符合生防菌初筛判断规律[4-5，18]。该菌株具有进一步开发应用的前景。
在对菌株HHH12的多相鉴定中，菌株的形态特征和测定的生理生化特征指标与文献报道的假单孢菌属特征描述基本吻合[13，17-18]，但16S rDNA序列构建的系统进化树显示的菌株HHH12与同源菌种16S rDNA序列的相似度仅为96%，未达到鉴定到同种序列相似度大于98%的一般要求，故将菌株HHH12归属于假单孢菌属，暂命名为Pseudomonassp.HHH12。
本研究通过盆栽试验进一步证实了菌株HHH12的生防活性，在灌根、叶面喷雾和灌根+叶面喷雾3种不同处理中，灌根+叶面喷雾的效果最好，单一灌根也取得了67.15%的防治效果。可见，灌根处理配合叶面喷雾具有一定的增效作用，这可能与菌株HHH12的内生特性有关，但不同功能微生物的发挥作用机制是极为复杂的，有待后续不断深入研究。
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