班甜甜，张素勤，马超，吴传递，徐彦军，李晓慧，耿广东
1.贵州省农业科学院园艺研究所，贵阳 550006；
2.贵州省园艺工程技术研究中心，贵阳550006；
3.贵州大学农学院，贵阳 550025
水分是影响植物生长的重要环境因子之一，水分过多可降低土壤中O2溶解度，形成缺氧或无氧的根系环境而危害植物［1］。近年来全球气候变暖导致异常天气增多，其中洪涝对农业生产构成极大威胁［2］。洪涝是中国发生几率最高、影响范围最广以及造成损害最大的自然灾害，西南地区受台风影响，夏季经常发生暴雨洪涝灾害，严重影响植物的正常生长，甚至引起植株的死亡，对农业生产造成不利影响。水涝条件下，植物活性氧（reactive oxygen spe‑cie，ROS）代谢失衡，造成过氧化氢（H2O2）、超氧根阴离子（O2−）等大量积累，过多的 ROS导致细胞氧化和膜系统受损［3］，产生膜质过氧化物丙二醛（MDA），与酶发生链式反应，造成膜系统变性，影响植株正常生理代谢，最终导致产量降低。研究表明，玉米苗期淹水3～7 d可使产量降低58.80%～69.80%［4］；
绿豆始粒期淹水可使产量降低18.07%～28.87%［5］；
大豆V3 期淹水可使单株产量降低11.11%［6］。高水平的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性在植物抵御淹水胁迫中发挥重要作用［7］，可以有效维持 ROS平衡，同时通过渗透调节物质含量的变化调节细胞的渗透势，保证植株的生长［8-9］。
草石蚕（Stachys sieboldiiMiq.）是唇形科水苏属多年生草本作物，也是一种以地下茎为食用部分的特色蔬菜，富含水苏糖、脂肪、蛋白质、维生素等，营养价值丰富，有补血、强身、清热解毒、治咳嗽等功效［10］。草石蚕喜湿润的环境，但在西南地区由于雨水过多，长期水涝导致土壤板结，限制地下茎的生长，严重影响草石蚕的产量，加强草石蚕抗涝品种筛选和涝害生理特性研究，对于深入了解草石蚕抗涝机制及有针对性地提出抗涝技术措施具有重要的理论价值和实践意义。目前，对玉米［11］、黄瓜［12］、辣椒［13］等作物水涝胁迫研究较多，而关于草石蚕的相关研究还鲜见报道。因此，本研究以3个草石蚕品种为试材，研究水涝胁迫对其叶绿素含量、渗透调节物质、保护酶活性以及膜脂过氧化产物的影响，以期解析草石蚕的抗涝机制，建立抗涝性评价方法，为选育抗涝性品种提供理论依据。
1.1 供试材料
供试材料为“贵栽1号”（贵州务川主栽品种）、“鲁引1号”（山东滨州主栽品种）和“赣引1号”（江西萍乡主栽品种）。
1.2 试验方法
试验在贵州大学农学院教学实验基地大棚内进行，每个小区2畦，畦面宽100 cm，每畦种植2行，株距40 cm。常规管理，待6-7月份（旺盛生长期，且为雨季时期）时进行水涝处理（在做畦前先将土挖出铺上塑料膜后再填上，进行水涝处理时向小区人工放水，使水淹过土壤表面，保证土壤中的水分一直处于饱和状态），胁迫1、3、5、7 d后，分别测定各品种的相关生理指标，以正常浇水管理的草石蚕为对照，每个小区面积为10 m2，3次重复，随机排列。于08：00-09：00采样，所采样品为从上到下第3和第4片叶。
1.3 测定方法
样品叶采用95%乙醇-丙酮混合液浸泡、提取，测定叶绿素含量［14］；
采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶性蛋白含量，茚三酮比色法测定脯氨酸（proline，Pro）含量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量［15］。参照文献［15］测定SOD、POD和CAT活性。
1.4 主成分分析
对3个品种草石蚕的叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量等数据进行标准化处理后，采用SPSS 22.0进行主成分分析，依据其特征值和贡献率等，计算草石蚕的抗涝性得分。
1.5 数据处理
用 Excel 2003整理数据并绘制图表，用SPSS 22.0软件进行显著性、相关性及主成分分析。
2.1 水涝胁迫对草石蚕叶绿素含量的影响
试验结果（图1）显示，水涝胁迫处理后3种草石蚕叶绿素含量先升高后降低。“贵栽1号”叶绿素含量在水涝胁迫3 d后达到最大值，较对照升高了9.59%，两者之间具有极显著差异（P<0.01）。“鲁引1号”和“赣引1号”水涝胁迫5 d后达到最大值，分别较对照升高了8.90%、13.96%，而“贵栽1号”叶绿素含量处理3 d后则有所下降。水涝胁迫7 d后，3种草石蚕的叶绿素含量均有所降低。
图1 水涝胁迫下草石蚕叶绿素含量的变化Fig.1 The change of chlorophyll content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress
2.2 水涝胁迫对草石蚕可溶性糖含量的影响
从图2可见，3种草石蚕可溶性糖含量均呈先升高后降低的变化。水涝胁迫1 d，3种草石蚕可溶性糖含量均高于对照，且达到极显著差异水平（P<0.01）。水涝胁迫3 d，“贵栽1号”可溶性糖含量达到最大值，较对照升高了33.05%；
“鲁引1号”和“赣引1号” 在胁迫5 d后可溶性糖含量达到最大值，分别高于对照25.98%和28.54%，与胁迫3 d的可溶性糖含量差异极显著。水涝胁迫7 d后，3种草石蚕可溶性糖含量均比胁迫5 d时有所降低，但仍高于对照，且与对照间差异极显著。胁迫7 d后，“赣引1号”升高幅度最大，“鲁引1号”次之，“贵栽1号”最低。
图2 水涝胁迫下草石蚕可溶性糖含量的变化Fig.2 The change of soluble sugar content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress
2.3 水涝胁迫对草石蚕可溶性蛋白含量的影响
从图3可以看出，3种草石蚕可溶性蛋白含量随水涝胁迫时间延长均呈先升高后降低的变化趋势。水涝胁迫3 d后，3种草石蚕可溶性蛋白含量均有所增加，“贵栽1号”可溶性蛋白含量达到最大值，高于对照23.46%，两者之间差异极显著（P<0.01）。“鲁引1号”和“赣引1号”可溶性蛋白含量在胁迫5 d后达到最大值，分别高于对照22.65%和27.89%。水涝胁迫7 d后，3种草石蚕可溶性蛋白含量下降，但仍高于对照。在胁迫处理末期，“赣引1号”可溶性蛋白含量较对照的升高幅度最大。
图3 水涝胁迫下草石蚕可溶性蛋白含量的变化Fig.3 The change of soluble protein content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress
2.4 水涝胁迫对草石蚕Pro含量的影响
由图4可见，水涝胁迫处理后“鲁引1号”和“赣引1号”Pro含量先升高后降低，而“贵栽1号”则一直升高。水涝处理1 d后，3种草石蚕Pro含量均高于对照，且与对照之间的差异极显著（P<0.01），“贵栽1号”“鲁引1号”和“赣引1号” Pro含量分别比对照增加30.73%、51.59%和89.06%。水涝胁迫5 d后，“鲁引1号”和“赣引1号”Pro含量均达到最大值，分别与对照和胁迫3 d后的Pro含量均达到极显著差异水平。水涝胁迫7 d后，“贵栽1号”的Pro含量达最大值，比对照升高97.93%，而“鲁引1号”与“赣引1号”Pro含量有所降低，但仍高于对照。水涝胁迫7 d后，“赣引1号” Pro含量升高幅度最大。
图4 水涝胁迫下草石蚕脯氨酸含量的变化Fig.4 The change of proline content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress
2.5 水涝胁迫对草石蚕SOD活性的影响
试验结果（图5）显示，随水涝胁迫时间延长，“贵栽1号”和“鲁引1号”的SOD活性先升高后降低，“赣引1号”则一直升高。水涝胁迫3 d后“贵栽1号”SOD活性达到最大值，高于对照48.49%，并达到极显著差异水平（P<0.01）。水涝胁迫5 d后，“鲁引1号”SOD活性升高到最大值，较对照升高32.47%。水 涝 胁 迫7 d后，“赣 引1号”SOD活性 升 高到 最大值，比对照升高34.71%，“鲁引1号”和“贵栽1号”则低于水涝胁迫5 d的活性，但仍高于对照。水涝胁迫末 期，“赣引1号”SOD活性升高 幅 度 最 大，“鲁引1号”次之，“贵栽1号”最低。
图5 水涝胁迫下草石蚕SOD活性的变化Fig.5 The change of SOD activity of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress
2.6 水涝胁迫对草石蚕POD活性的影响
由图6可见，3种草石蚕的POD活性随水涝胁迫时间延长先升高后降低。水涝胁迫1 d后，3种草石蚕的POD活性均高于对照，且与对照间差异极显著（P<0.01）。
3种草石蚕的POD活性在胁迫5 d后达到最大值，“贵栽1号”“鲁引1号”和“赣引1号”分别比对照升高了66.37%、102.95%和104.46%。水涝胁迫7 d后，3种草石蚕的POD活性有所降低，但仍高于对照。胁迫末期，“赣引1号”的升高幅度最大，“贵栽1号”升高幅度最小。
图6 水涝胁迫下草石蚕POD活性的变化Fig.6 The change of POD activity of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress
2.7 水涝胁迫对草石蚕CAT活性的影响
由图7可见，3种草石蚕CAT活性随水涝胁迫时间延长先升高后降低。水涝胁迫1 d，3种草石蚕CAT活性均高于对照，且差异极显著（P<0.01）（图7）。3种草石蚕的CAT活性在胁迫5 d后达到最大值，“贵栽1号”“鲁引1号”和“赣引1号”分别比对照升高了280.65%、260.29%和266.67%。水涝胁迫7 d后，3种草石蚕CAT活性有所降低，但仍高于对照。胁迫处理末期，“赣引1号”和“鲁引1号”升高幅度大，“贵栽1号”CAT活性升高幅度小。
图7 水涝胁迫下草石蚕CAT活性的变化Fig.7 The change of CAT activity of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress
2.8 水涝胁迫对草石蚕MDA含量的影响
3种草石蚕MDA含量随水涝胁迫时间的延长一直增加。水涝胁迫1 d后，3种草石蚕MDA含量与对照之间差异极显著（P<0.01）。水涝胁迫7 d后，3种草石蚕 MDA含量均达到最大值，且分别高于对照256.86%、282.93%和301.20%；
胁迫末期，“赣引1号” MDA含量升高幅度最小，“贵栽1号”MDA含量升高幅度最大（图8）。
图8 水涝胁迫下草石蚕MDA含量的变化Fig.8 The changeof MDA content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress on
2.9 草石蚕各生理指标的相关性分析
水涝胁迫处理后草石蚕各生理指标间的相关性分析结果（表1）显示，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、SOD活性、POD活性之间的相关系数均>0，绝对值均>0.8，因此，各指标之间均呈极显著正相关。MDA含量与其他生理指标之间均呈负相关；
叶绿素含量与可溶性糖含量、可溶性蛋白含量呈显著正相关，与SOD活性、CAT活性呈极显著正相关；
CAT活性与Pro含量、MDA含量、POD活性呈一定程度负相关，但相关性均不显著。综上，各项生理指标间存在一定的相关性，但相关程度不一致。因此，可用主成分降维的方法对草石蚕的8个生理指标进行主成分分析，综合评价草石蚕的抗涝性。
表1 草石蚕各生理指标间的相关性分析Table 1 Correlation analysis of Stachys sieboldii Miq. physiological indexes
2.1 0 3种草石蚕的抗涝性评价
1）主成分分析。对水涝胁迫后草石蚕各生理指标进行主成分分析，得到初始特征值、方差贡献率、累计方差贡献率和旋转平方和后的特征值、方差贡献率、累计方差贡献率（表2）。选取初始特征值大于1的前2个主成分，第1主成分的方差贡献率为 78.510%，第2主成分的方差贡献率为15.490%，累计方差贡献率达94%，可代表8个原始性状94%的数据信息。可用这2个主成分代替上述8个生理指标进行抗涝性综合评价。
由表3可知，第1主成分得分系数为正且较大的指标有可溶性糖、可溶性蛋白、Pro、SOD和POD，表明这5项指标对第1主成分的贡献较大；
第2主成分得分系数为正且较大的指标有叶绿素、SOD和CAT，这3项指标对第2主成分的贡献较大。
2）抗涝性综合评价。通过对 2个主成分的得分系数（表3）和8个生理指标（X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分别代表叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、MDA活性、SOD活性、POD活性、CAT活性）进行处理，建立2个主成分的线性回归方程如下：
表3 主成分得分系数Table 3 The matrix of principal component scoring coefficient
然后以每个主成分所对应的方差贡献率作为权重系数，计算草石蚕的综合得分。从表2可见，2个主成分旋转后的方差贡献率分别为70.482%和23.518%，故3种草石蚕的综合得分公式为：FZ=70.482%×F1+23.518%×F2。各主成分得分和综合得分见表4，“鲁引1号”“赣引1号”和“贵栽1号”综合评价的抗涝性得分分别为-0.174、0.815、-0.641，评价得分最高的为“赣引1号”，其抗涝性最好。
表2 各成分特征值和贡献率Table 2 The characteristic value and contribution rate of each component
表4 草石蚕主成分得分及综合评价Table 4 Principal component score and comprehensive evaluation value of S. sieboldii Miq.
水分作为植物生长的重要环境因子，可影响植物的形态、生理生化以及地理分布。水涝胁迫严重影响植物生长发育，胁迫时间越长伤害越大［16］。
3.1 水涝胁迫对草石蚕叶绿素及渗透调节物质的影响
叶片是植物最敏感的器官，逆境胁迫下叶片往往最先表现出症状［17］。本试验3种草石蚕的叶绿素含量均随胁迫时间的延长先升高后降低，这与宴增等［18］对黑杨幼苗的研究结论一致。胁迫初期叶绿素含量升高，这可能是草石蚕喜水性的嗜水生理反应，促进了叶绿素的合成，以维持生存所需的光合能力［19］。随水涝时间的延长，3种草石蚕的叶绿素含量均下降，表明水涝胁迫末期抑制了叶绿素合成，加快了叶绿素的降解［20］，进而影响草石蚕的生长。植物体内的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro等渗透调节物质具有保护酶活性和细胞膜结构的功能［21］。本试验3种草石蚕的渗透调节物质均随胁迫时间的延长先升高后降低，与张志浩等［22］对花椒的研究结果一致。Pro含量的增加既可提高细胞的渗透调节能力，还可以清除活性氧，增强植株抗氧化能力［23］，这对提高植物的逆境抗性是有益的。水涝胁迫3 d后“鲁引1号”和“赣引1号”的可溶性糖、可溶性蛋白、Pro含量继续升高，表明这2种草石蚕在水涝胁迫下具有较好的渗透调节能力，“贵栽1号”的可溶性糖、可溶性蛋白在胁迫3 d后，达到最大值，然后下降，因此，“贵栽1号”的渗透调节能力较差。可溶性糖和Pro含量初期上升是因为植株自身的自我保护机制，但这种自我调节作用有一定的限度，当外界的胁迫程度超过自身的调节能力时就会对植株造成伤害，其含量开始下降［24］；
可溶性蛋白含量前期升高是由于水涝胁迫刺激了蛋白合成，后期含量降低是因为降解大于合成［25］。
3.2 水涝胁迫对草石蚕过氧化及抗氧化相关指标的影响
叶片 MDA 含量为逆境胁迫下植物受害程度的重要指标，淹水胁迫会造成膜脂过氧化反应加剧，导致膜系统受损，从而影响膜透性，间接反映植物组织抗氧化的能力［26］。本试验中，3种草石蚕MDA含量均随水涝胁迫的延长而上升，这与王桂林等［27］的研究结果一致，“贵栽1号”和“赣引1号”含量的变化规律与汪宗立等［28］的研究结果一致，均为前期缓慢上升，后期快速上升。这表明随胁迫时间的延长，叶片细胞质膜透性增大，导致细胞各项功能紊乱，危害植物的生长，这与叶绿素含量和渗透调节物质含量在胁迫末期下降的反应一致。“贵栽1号”和“赣引1号”MDA含量后期快速上升，是因为随胁迫时间的延长细胞内的活性氧大量积累，膜脂过氧化作用加剧，草石蚕对水涝胁迫的适应性逐渐下降。胁迫末期“赣引1号”MDA含量较对照的升高幅度最小，表明其膜脂过氧化程度最低。
植物在遭受逆境胁迫时，可通过改变体内SOD、POD、CAT 等酶的活性清除大量的自由基，抵御外界的伤害［29］。试验表明，“鲁引1号”和“贵栽1号”的SOD活性和3种草石蚕的POD和CAT活性均呈先升高后降低的变化，这与裴姿琛等［30］、张晓佩等［31］的研究结果一致，抗氧化酶活性随胁迫时间的延长而降低，可能源于持续的涝害导致植株的抗涝机能已无法发挥作用，与文中MDA的含量一直升高的结果相对应。一般来说，耐涝能力强的植物，抗氧化酶的活性会显著升高［32］，根据综合评价结果可知“赣引1号”的抗涝性最强，水涝胁迫1～7 d其SOD活性一直在升高，胁迫末期较对照的升高幅度最大。
3.3 草石蚕抗涝性综合评价
植物的抗涝性是由多种因素互作而构成的一个比较复杂的综合性状，用单一指标评价具有局限性，需将多个指标进行综合分析才能科学反映植物的抗涝性［33-34］。本研究通过对草石蚕的8个生理指标进行相关性分析发现，各指标间存在复杂的相关性，给草石蚕抗涝性的鉴定带来一定的困难。本研究通过主成分分析将8个指标降维为2个主成分，根据3种草石蚕的得分，明确3种草石蚕的抗涝性为“赣引1号”>“鲁引1号”>“贵栽1号”。
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