何宇城，俞锰锰，韦艳雪，王 超，付 晨，陈豪羿，梅高翔，辛振麒，马国荣，袁建锋
（1. 浙江师范大学行知学院，浙江金华 321004；
2. 浙江兰溪锦荣生物科技股份有限公司，浙江金华 321004）
桃胶别名桃树胶。桃、李等蔷薇科植物的树干受外力割伤，或者被微生物感染后，伤口处分泌的胶质物即为桃胶。新鲜的桃胶颜色为浅红色或者浅黄色，呈半透明状。桃胶干燥后质地由胶质变为质地坚硬的固体，使用工具切割，可见切割面有光泽感[1]。桃胶中含有大量多糖，主要组成有鼠李糖、半乳糖、α - 葡萄糖醛酸等[2]，中医认为其具备益气、活血、止渴之功效，也能降低血脂[3]。随着研究的不断深入，桃胶目前在化妆品、印染、化工、食品、医药等领域已有应用[4]。
多糖的提取主要有溶剂提取法[5]、微波辅助提取法[6]、酶辅助提取法[7]、双水相提取法[8]、超声波辅助提取法[9]、超滤法[10]、高压脉冲法[11]等方法。超声波提取法是利用超声波产生的机械振动，破碎桃胶的细胞壁和细胞膜，在短时间内使其多糖扩散到溶剂中。故采用超声波辅助提取桃胶多糖，通过响应面法确定其最佳工艺条件，以期为桃胶多糖提取产业化提供一定理论参考。
1.1 材料与仪器
桃胶，购自浙江金华磐安；
3,5 -二硝基水杨酸、氢氧化钠、苯酚、亚硫酸氢钠、葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司提供。
JY92-ⅡN 超声波细胞粉碎仪弄，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；
料理机，美的集团股份有限公司产品；
Eppendorf centrifuge5810 R 型离心机，德国艾本德股份公司产品。
1.2 标准曲线的绘制
准确称取100 mg 葡萄糖，加蒸馏水溶解，转移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度；
将其稀释，得到葡萄糖标准溶液，配置质量浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL 梯度的葡萄糖待测液。再加入DNS 试剂5 mL，100 ℃下水浴反应5 min，冷却后定容至25 mL，用分光光度计测定波长540 nm 处的吸光度。
1.3 桃胶的预处理
用料理机将购自浙江金华磐安的桃胶打成粉末，用80 目筛过滤，得到桃胶粉末。
1.4 桃胶多糖的提取
用蒸馏水按一定的料液比溶解桃胶粉末，在不同的超声功率下提取相应时间，离心得到上清液，加入6 mol/L 盐酸，沸水浴条件下加热1 h。冷却后加蒸馏水稀释，并且加入氢氧化钠稀释成中性，得桃胶多糖稀释液。
1.5 单因素试验
为获得桃胶多糖提取的最佳工艺，考查不同料液 比（1 ∶100，1 ∶150，1 ∶200，1 ∶250，1 ∶300）、超声功率（125，150，175，200，225 W）、提取时间（10，15，20，25，30 min） 对桃胶多糖得率的影响。
1.6 响应面试验
选取单因素试验中3 个最优水平，构建三因素三水平响应面，优化桃胶多糖提取工艺。
1.7 样品多糖含量测定
运用上述DNS 法，将提取液重复测定3 次，取3 次测得吸光度的平均值，然后代入线性方程计算出多糖的含量。
2.1 标准曲线的测定
葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，得到方程Y=9.39X-0.037 6，R2=0.999。结果表明当葡萄糖质量浓度为0.02~0.10 mg/mL 时，与吸光度线性关系较好。
葡萄糖标准曲线见图1。
图1 葡萄糖标准曲线
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对桃胶多糖得率的影响
料液比对桃胶多糖得率的影响见图2。
图2 料液比对桃胶多糖得率的影响
在提取功率200 W，提取时间15 min 的条件下，由图2 可知，逐步增加料液比，桃胶多糖得率不断提高，在料液比为1∶200 时，桃胶多糖得率最高。进一步增加料液比，桃胶多糖得率下降。可能是过多的溶剂分散了超声波对桃胶粉末的作用[12]。试验选取料液比1∶150，1∶200，1∶250（g∶mL） 进行响应面优化分析。
2.2.2 超声功率对桃胶多糖得率的影响
超声功率对桃胶多糖得率的影响见图3。
图3 超声功率对桃胶多糖得率的影响
在料液比1∶200，提取时间15 min 的条件下，由图3 可知，超声功率为125~175 W，多糖得率随着超声功率的增加而增加，功率大于175 W 时，多糖得率略有下降。超声波可使细胞壁破坏，利于多糖溶出，但当超声功率过高时，可能会引起局部温度过高，导致多糖结构被破坏，得率下降[13]。试验选取超声功率150，175，200 W 进行响应面优化分析。
2.2.3 提取时间对桃胶多糖得率的影响
提取时间对桃胶多糖收率的影响见图4。
图4 提取时间对桃胶多糖收率的影响
在料液比1∶200，提取功率200 W 的条件下，由图4 可知，在10~20 min 时，多糖得率随着时间的增加而增加，20 min 后得率下降。可能是因为过长时间的超声会破坏多糖分子结构，导致得率下降。试验选取提取时间15，20，25 min 进行响应面优化分析。
2.3 响应面法优化桃胶多糖的提取工艺
Box-behnken 中心组合试验因素与水平设计见表1，响应面试验设计与方差分析见表2。
表1 Box-behnken 中心组合试验因素与水平设计
表2 响应面试验设计与方差分析
对表3 试验数据进行分析，得到二次多项回归模型为：
二次模型的方差分析见表3。
表3 二次模型的方差分析
此模型的p值＜0.01，具有显著性差异，说明该多项式数学模型对试验拟合度较好。A2对得率有显著性影响，C2对得率有极显著影响。桃胶多糖得率受提取时间的影响最大，其次是料液比，最后是提取功率。
料液比和超声功率对多糖得率的影响见图5，料液比和超声时间对多糖得率的影响见图6，超声功率和超声时间对多糖得率的影响见图7。
图5 料液比和超声功率对多糖得率的影响
图6 料液比和超声时间对多糖得率的影响
图7 超声功率和超声时间对多糖得率的影响
通过Design Expert 8.0.6 软件对响应面数据进行优化，得到最佳工艺为料液比1∶203.5，超声功率181 W，时间20.35 min 时，理论得率可达到83.97%。
为检验响应面模型是否拟合较好，设置料液比1∶203.5，超声功率181 W，超声时间20.35 min 试验组，进行3 次平行试验，测得桃胶多糖得率为83.94%，与理论值较为接近，说明响应面模型拟合度较高。
以桃胶粉碎后的粉末为原料，通过3 个不同的因素（料液比、超声功率和超声时间） 来进行响应面法的优化，最终得到了桃胶多糖提取工艺参数为料液比1∶203.5，超声功率181 W，超声时间20.35 min时，实际桃胶多糖得率可达到83.94%，为桃胶多糖提取工艺提供理论基础。
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