胡夏宇 刘玉萍 苏 旭，3* 杨 萍 王亚男
（1. 青海师范大学，生命科学学院，西宁 810008；
2. 青海师范大学，高原科学与可持续发展研究院，西宁 810016；
3. 青海师范大学，青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，西宁 810008）
苦豆子（Sophora alopecuroides）又名苦甘草、欧苦参，是豆科（Fabaceae）苦参属（Sophora）的一种多年生草本植物［1］，主要分布于我国西北、华北等地［2］，尤其新疆、内蒙古、甘肃、青海、山西、宁夏、陕西、河北8 个省区是其适宜生长区［3］；
此外，俄罗斯、阿富汗、伊朗、土耳其、巴基斯坦和印度北部也有少量分布［1］。苦豆子通常生长于海拔1 000～2 000 m 的荒漠、半荒漠地区［4］，具有较强的耐旱、耐寒、耐盐碱、抗风沙等特性，是我国西北荒漠、半荒漠地区重要的防风固沙植物［5］。
研究表明，苦豆子富含蛋白质、生物碱、挥发油及黄酮类化合物［6］，根、茎、叶和种子均可入药，具有重要的药用价值［7-8］，亦可作为优质畜牧业饲料［8］，同时也是我国西北荒漠草原的一种重要蜜源植物［8-9］。迄今为止，国内外关于苦豆子的研究主要集中于其生物学特性［1，10］、耐逆生理［5，11］、遗传多样性［11-12］、根际微生物［13］、化学成分［14］、药用价值［7-8］、饲用价值［8，15］、种质资源［16］以及资源化利用途径［10，17］等，然而目前对苦豆子染色体形态与数目以及核型特征的研究较少［18-21］。
染色体是真核生物遗传信息的载体，其形态、数目和结构是较为稳定的细胞学特征，不易受外界环境变化而改变。染色体核型是细胞染色体组有丝分裂中期时的表型，如染色体数目、大小、形态等特征；
染色体核型分析即是从细胞水平上对染色体的形态特征进行认真描述和研究［22］。已有研究表明，通过对植物染色体长度、长短臂比等数量特征的测量以及对着丝点位置、随体有无等质量特征的判别，可为有效推断植物物种的系统位置、亲缘关系乃至同一物种不同居群间的系统进化提供强有力的细胞学证据［23］，同时对植物种质资源保护及遗传育种和新品种选育也具有重要指导作用［24］。目前，国内外诸多学者利用植物染色体常规压片技术对豆科植物的染色体核型进行了较为系统的探讨，取得了卓著的成效［25-26］。如孔红等［25］通过对豆科银砂槐（Ammodendron bifolium）和盐豆木（Halimodendron halodendron）2 种荒漠植物染色体核型研究，发现银砂槐染色体类型为正中部着丝点染色体和中部着丝点染色体2种类型，核型属1A 型；
盐豆木染色体类型为中部着丝点染色体、近中部着丝点染色体和近端部着丝点染色体3种类型，核型属2A 型，盐豆木核型较银砂槐核型进化。杨萍［26］分析甘草属（Glycyrrhiza）4个物种的核型时，发现4种甘草的染色体数目均为2n=2x=16，核型类别为1A 型，光果甘草（G.glabra）最进化、甘草（G. uralensis）与胀果甘草（G. inflata）较进化且亲缘关系较近、刺果甘草（G.pallidiflora）最原始。有学者［18，20-21］通过对苦豆子染色体核型的分析表明，苦豆子染色体核型公式为2n=2x=36=26m+8sm+2st，核型类型为2A 型，而朱必才等［19］的研究却得出不同的结论。关于我国西北荒漠地区的优势物种苦豆子的染色体数目、形态以及核型类型的研究至今仍没有获得一致结论，也鲜见从群体水平对苦豆子进行染色体核型特征及亲缘关系的报道。据此，本研究采用常规染色体压片技术，对苦豆子不同居群的染色体数目和核型特征进行综合分析，系统探讨其核型差异及亲缘关系，旨在为今后苦豆子群体遗传学、基因组学和进化生物学的研究提供细胞学方面的参考依据。
1.1 研究材料
苦豆子不同居群的成熟种子采自甘肃武威市、宁夏银川市及内蒙古阿拉善盟与鄂尔多斯市。凭证标本保存于中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物标本馆（QTPMB），详细采样信息见表1。
表1 试验材料及来源Table 1 Experimental materials and sources
1.2 试验方法
1.2.1 种子萌发
从苦豆子各参试居群中筛选10 个个体，每个个体中挑选10粒成熟饱满的种子。将种子放入冰箱于-20 ℃低温处理24 h。在培养皿底部平铺双层滤纸并用蒸馏水湿润至有水析出时，将低温处理后的种子均匀放置于培养皿中（同一个体的种子放于1 个培养皿中）。最后，将放有种子的培养皿置于恒温培养箱中25 ℃培养，待根长至0.5～1.0 cm时，进行取样。
1.2.2 预处理
剪下的苦豆子根尖放入预先用蒸馏水润湿的2.0 mL 离心管中，保持离心管内外湿润。然后打开管盖并将其置于盛有N2O 的密封罐中，压强设为0.55 MPa，处理130 min。
1.2.3 固定与解离
从密封罐中取出离心管后，迅速加入卡诺氏固定液（V（冰乙酸）∶V（无水乙醇）=1∶3，现配现用）。然后盖紧管盖，轻轻翻转离心管，使根尖组织与固定液充分接触。放入冰箱中于4 ℃固定10 min以上，将固定好的根尖用体积分数45%乙酸解离5 min。
1.2.4 染色与压片
参照费昭雪等［27］的方法，将解离好的根尖置于载玻片中央，用刀片切除多余部分，仅留下根尖顶端分生组织。滴1滴改良石炭酸品红溶液，染色7～8 min。用盖玻片将组织盖压并用镊子后端敲击使组织充分分散。随后将载玻片悬于酒精灯火焰上微烤，使组织区域水分迅速蒸发。用滤纸覆于盖玻片上，拇指垂直向下按压，除去盖玻片与载玻片间的空隙，使细胞充分分散并与玻片紧密贴合，便于观察。
1.2.5 观察与拍照
制作好的染色体装片置于荧光显微镜（Olympus BX53，日本）下观察，选择细胞结构完整，染色体分散、形态清晰的染色体拍照。
1.2.6 核型数据分析
每个居群选取至少3 张清晰完整的根尖染色体中期分裂图，参照邓爱辉等［28］方法确定染色体数目，利用Adobe Photoshop 2019 软件统计每个个体的染色体数目，测量各染色体长、短臂长度［29］，并将这些原始数据导入Excel 中，依据Levan 等［30］方法计算染色体相对长度（RL）、长度比（CLR）、臂比（AR）等参数，依据李懋学等［31］方法进行核型分析，依据Kuo等［32］方法计算相对长度系数（I.R.L），依据Arano［33］方法计算核型不对称系数（As.K%），依据Stebbins［34］方法对每个居群的染色体核型进行分类。
1.2.7 核型进化趋势和聚类分析
利用Excel 软件绘制苦豆子核型不对称性程度散点图，即核型二维进化图，参照邢世岩等［35］方法进行核型进化趋势分析；
利用SPSS 26软件统计苦豆子染色体臂比平均值（MAR）、方差、相对长度方差、染色体长度比（CLR）和正中部着丝粒（M）、中部着丝粒（m）、近中部着丝粒（sm）或近端部着丝粒（st）染色体比例等参数，依据李晓莉等［36］方法进行聚类分析。
2.1 苦豆子不同居群染色体数目和倍性
通过对苦豆子不同居群有丝分裂中期染色体数目与形态的观察，发现苦豆子居群的染色体倍性均为二倍体，数目为2n=2x=36，参试居群中未发现染色体数目和形态变异（见图1），表明苦豆子染色体数目和形态较为稳定。
图1 苦豆子有丝分裂中期染色体Fig.1 Mitotic chromosomes in metaphase of S.alopecuroides
2.2 苦豆子不同居群染色体形态特征和类型
根据苦豆子染色体核型参数，将其36 条染色体进行同源染色体配对，共获得18 对；
染色体类型包括m 和sm 两种，除居群3 具有m 和sm 两种类型外，其余参试居群仅具有m 类型（见表2）。依据染色体相对长度系数及Kuo 等［32］分类标准，苦豆子各参试居群染色体可以被划分为长染色体L 型（≥1.26）、中长染色体M2型（1.01～1.25）、中短染色体M1型（0.76～1.00）和短染色体S 型（＜0.76）4 种类型；
除居群3 无S 型染色体外，其余居群均包含以上4 种类型染色体（见表2）。
表2 苦豆子不同居群染色体参数Table 2 Chromosome parameters in different populations of S.alopecuroides
续表2 Continued toble 2
续表2 Continued toble 2
2.3 苦豆子不同居群染色体核型分析
苦豆子不同居群染色体核型模式图和核型参数见图2 和表3。由表3 可知，苦豆子不同居群的染色体核型类型有1A、3A 和2B 三种，其中居群3为3A 型、居群5 和13 为2B 型、居群17、19 和43 为1A 型；
就苦豆子染色体长度比而言，居群13 的长度比最大（2.19），居群3的长度比最小（1.72）；
在染色体平均臂比上，居群3 的平均臂比最大（1.37），居群19 的平均臂比最小（1.19）；
就核不对称系数来说，居群3 的核不对称系数最大（57.17%），表明该居群的染色体核型对称性最差，居群19 的核不对称系数最小（54.30%），表明该居群的染色体核型对称性最好。因此，这些结果说明苦豆子各参试居群间的染色体核型差异较为明显。
表3 苦豆子不同居群核型比较Table 3 Karyotype comparison in different populations of S.alopecuroides
图2 苦豆子不同居群染色体核型模式Fig.2 Chromosome idiograms in different populations of S.alopecuroides
2.4 苦豆子不同居群染色体核型进化趋势分析
本研究结果表明，苦豆子染色体核型呈“双向进化趋势”，即苦豆子有些居群沿染色体平均臂比方向进化较快，如居群3（甘肃武威）；
另一些居群则沿染色体长度比方向进化较快，如居群13（内蒙古阿拉善）（见图3A）。就苦豆子居群的染色体核型总体进化趋势而言，二维图右上方苦豆子居群通常具有较高的进化程度，而左下方苦豆子居群往往进化程度较低，因而认为苦豆子居群19（内蒙古鄂尔多斯）的进化程度较低，居群3 的进化程度相对较高（见图3A）。同样，基于苦豆子居群染色体平均臂比和核型不对称系数，发现苦豆子居群总体沿二维图右上角方向进化，其中居群3的染色体平均臂比和核型不对称系数最大，表明进化程度较高；
而居群19 的染色体平均臂比和核型不对称系数最小，说明进化程度较低（见图3B）。因此，本研究认为苦豆子居群19的起源较早，进化程度较低，而居群3的起源较晚，进化程度较高（见图3）。
图3 苦豆子不同居群染色体核型进化趋势Fig.3 Evolutionary trend of chromosome karyotypes in different populations of S.alopecuroides
2.5 苦豆子不同居群染色体核型聚类分析
苦豆子居群染色体核型聚类分析表明，当遗传距离为1 时，苦豆子6 个参试居群聚集为4 个分支，其中居群5（甘肃武威）和13（内蒙古阿拉善）聚为C分支，居群19（内蒙古鄂尔多斯）和43（内蒙古鄂尔多斯）聚为E 分支，居群3（甘肃武威）、17（宁夏银川）分别聚为D 分支和F 分支；
而当遗传距离为11 时，苦豆子6 个参试居群则聚集为2 大分支，居群3、5和13聚为A分支，居群17、19和43聚为B分支（见图4）。
图4 苦豆子不同居群染色体核型聚类分析Fig.4 The clustering analysis of chromosome karyotypes in different populations of S.alopecuroides
本研究结果显示，苦豆子不同居群的染色体数目均为36 条，2n=2x=36，为二倍体植物，各参试居群染色体均未见随体存在，这与先前学者报道的结果［18-19，21］一致。然而，陈荃等［20］在对2 种豆科荒漠植物骆驼刺（Alhagi sparsifolia）和苦豆子进行染色体观察时，发现苦豆子的同一根尖材料中存在2n=34、33 的异数染色体，推测可能是压片时用力不均导致染色体重叠或散出细胞外而造成。同时，本研究还发现苦豆子居群3的染色体核型公式为2n=2x=36=35m+1sm，而其他5 个居群的核型公式均为2n=2x=36=36m，这与先前朱必才等［19］和牛凯等［21］的研究结果有所不同，朱必才等［19］研究发现苦豆子的染色体核型公式为2n=2x=36=8sm+28m，牛凯等［21］认为新疆地区苦豆子的染色体核型公式为2n=2x=36=26m+8sm+2st。据此，认为同一物种为了适应不同的生长环境条件，其在染色体形态上会发生变化产生差异，这是染色体形态多样化的表现，也是植物适应环境条件长期演化的结果［37］。因此，苦豆子不同居群染色体形态差异对其今后引种驯化、遗传育种和新品种选育具有重要参考价值。
通过对苦豆子6个参试居群染色体核型分析，发现苦豆子的染色体类型有m 和sm 两种，绝大多数类型为m 型，属于较对称性染色体；
核型类型有1A、3A 和2B 三种；
染色体核不对称系数介于54.30%～57.17%，长度比为1.72～2.19，平均臂比为1.10～1.83，6个参试居群的进化程度由高到低依次为P03、P43、P13、P05、P17、P19，我们认为苦豆子在染色体长度比和平均臂比上存在“双向进化趋势”。先前研究表明，植物的进化程度与其环境适应性和丰产性具有密切关系［38］，通常表现为植物对环境的适应性越强其进化程度越高［39］。因此，我们推测苦豆子所有参试居群中，居群3（甘肃武威）应对外界环境具有最强的适应性，可以作为将来苦豆子引种驯化和优良新品种选育的重要种质资源。此外，研究认为植物染色体核型聚类分析可以直观反映不同物种或同一物种不同居群间的遗传分化和亲缘关系［40］。本研究结果显示，当遗传距离为11时，苦豆子6个参试居群聚集为A和B两大分支，其中A 分支包括居群3、居群5 和居群13，表明这3 个居群具有较近的亲缘关系；
B 分支包括居群17、居群19 和居群43，说明它们彼此间亲缘关系较近。基于苦豆子采样信息数据，发现苦豆子不同居群间的亲缘关系与其地理距离远近不具有相关性，其主要与生境相似度有关，这为今后苦豆子种质资源的合理开发利用提供了重要理论依据。总之，本研究从居群水平探讨了苦豆子的染色体核型类型、特征、进化程度及不同居群间的亲缘关系，为将来更多荒漠植物不同居群的染色体核型研究提供了一个典型案例。