贲海燕，郝永娟，霍建飞，姚玉荣，高 苇，王万立
(天津市农业科学院 植物保护研究所，天津 300381)
草莓白粉病是保护地草莓发病面积较大、发病频率较高的草莓病害之一，其病原菌是子囊菌亚门真菌羽衣草单囊壳菌(Sphaerothecaaphanis)，主要危害草莓的叶片和果实，有时还会危害草莓的花梗和叶柄，匍匐茎上很少发生[1]。草莓白粉病的发生贯穿草莓生长的各个阶段，并且该病在世界各地均有分布，我国较为寒冷的华北平原地区草莓白粉病发病较为严重[2-3]。近年来，保护地尤其是栽培条件良好的大棚更容易发生草莓白粉病，一旦发病，整棚的草莓都可能被感染，严重时病叶率超过45%，病果率超过50%，给种植农户带来了严重的经济损失[4]。
目前，施用化学农药仍然是防治草莓白粉病最主要的措施[5]。红颜、章姬等品种对草莓白粉病较为敏感，农户频繁使用药剂，导致病菌抗药性较高、草莓用药量居高不下，严重威胁着草莓的安全生产。因此，开展草莓白粉病预测预报研究对于科学防治草莓白粉病具有重要意义。传统的白粉病早期检测方法是根据发病组织症状、病原菌特征、研究人员的经验进行识别。由于白粉病引起的早期褪绿与其他病原引起的症状相似，因此，很难得出准确的判断[6]。另外，白粉病是专性寄生菌，不能进行人工培养，因此，不能简单依靠传统的分离培养、血清鉴定和ELISA等方法进行检测[7]。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本学者Notomi报道的一种新型核酸扩增技术，其能够识别靶序列上6个特异区域的4条正反向外引物和正反向内引物，利用高活性链置换DNA聚合酶，特异、高效地扩增靶基因[8]。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、Real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，还可以通过SYBR Green Ⅰ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后肉眼识别[9-10]。由于LAMP反应快速、高效，无需特殊设备，极适合在基层生产部门推广应用。目前LAMP检测主要用于人畜病原物、食品安全和环境卫生相关微生物的检测，在植物病原菌检测中也有较多报道[11-12]，而关于草莓白粉病菌的LAMP检测国内外均未见报道。因此，开发一种针对草莓白粉病菌可视化LAMP检测技术，对于草莓白粉病的早期诊断、病原菌鉴定，及时、高效地控制草莓白粉病的发生和蔓延具有重要的应用价值。
1.1 供试材料
供试菌株：草莓白粉病菌(Sphaerothecaaphanis(Wall.) Braun)为天津市农业科学院植物保护研究所蔬菜病害研究室采自感病品种，纯化后活体保存的菌株；
阴性对照菌株为其他作物白粉病病原菌及草莓上常见病害病原菌：黄瓜白粉病(单丝壳白粉菌Sphaerothecafuliginea)、辣椒白粉病(辣椒拟粉孢菌Oidiopsistaurica)、番茄白粉病(蓼白粉菌Erysiphepolygoni)、葡萄霜霉病(葡萄生单轴霜霉菌Plasmoparaviticola)、黄瓜霜霉病(古巴假霜霉菌Pseudoperonosporacubensis)、甜瓜白粉病(单囊壳白粉菌Sphaerothecafuliginea)、草莓根腐病(尖孢镰孢菌Fusariumoxysporum)、草莓灰霉病(灰葡萄孢菌Botrytiscinerea)、草莓炭疽病(胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides)、黄瓜靶斑病(多主棒孢菌Corynesporacassiicola)、番茄灰叶斑病(茄匍柄霉Stemphyliumsolani)和萝卜黑斑病(萝卜链格孢菌Alternariaraphani)。供试菌株均保存于天津市农业科学院植物保护研究所。
供试试剂：ITS4/ITS5(北京擎科生物科技有限公司)、甜菜碱和钙黄绿素(麦克林生物科技有限公司)、微生物基因组提取试剂盒T5 Direct PCR Kit(北京擎科生物科技有限公司)、Bst DNA polymerase和MgSO4(上海生物化工有限公司)、PCR Mix(北京擎科生物科技有限公司)、dNTP Mixture和DNA Ladder(北京全式金公司)等。
仪器：超净工作台(上海博迅实业有限公司)、中型冷冻高速离心机(德国艾本德股份公司)、Bio Rad PCR仪(美国伯乐公司)、实时荧光定量PCR仪(赛默飞世尔科技公司)、电热恒温水槽(上海赫田科学仪器有限公司)和核酸浓度检测仪(赛默飞世尔科技公司)等。
1.2 试验方法
1.2.1 供试菌株基因组DNA的快速提取及测序 病原菌DNA快速提取采用T5 Direct PCR Kit(北京擎科生物科技有限公司)。具体步骤如下：用灭菌牙签挑取少量草莓白粉病菌菌丝(天津市农业科学院植物保护研究所实验室保存)放入灭菌PCR管中，加入50 μL Lysis Buffer A溶液，95 ℃温育10 min后，10 000 r/min离心20 s，取上清液25～30 μL，加入等体积Dilution Buffer B溶液，使用振荡器振荡混匀，得到DNA溶液，用核酸浓度检测仪测定DNA浓度后，-20 ℃保存用于LAMP扩增试验。全基因组DNA提取过程用时15 min左右。提取DNA后进行ITS序列的PCR扩增，采用真菌通用ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)和ITS5(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)。PCR扩增体系为：25 μL TaqMaster Mix，DNA模板2 μL，引物各2 μL，dd H2O补足至50 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；
最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃保存备用。扩增产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序。
1.2.2 特异性LAMP引物设计 以测序的羽衣草单囊壳菌的ITS序列为靶标，在GeneBank数据库中下载多种白粉病菌的ITS序列(黄瓜白粉病菌、辣椒白粉病菌和番茄白粉病菌)，同时下载多种常见的草莓致病菌的ITS序列(草莓根腐病菌、草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌)。根据LAMP引物设计的原则，利用PrimerPremier 5 .0软件，针对其6个特定区域，设计一套草莓白粉病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3、1对内侧引物FIP/BIP和1对环引物LF/LB组成，具体信息如表1所示。
表1 用于草莓白粉病菌LAMP测试设计的引物组信息Tab.1 Designed primer set for LAMP detection of strawberry powdery mildew
1.2.3 LAMP实时荧光检测方法的建立及优化 LAMP初始检测体系建立(25 μL)：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL、终浓度为8 mmol/L的MgSO41.5 μL、终浓度为1.4 mmol/L的dNTPs 3.5 μL、终浓度为0.8 mmol/L的甜菜碱0.4 μL、终浓度为80 U/μL的BstDNA聚合酶0.25 μL、DNA模板2.0 μL、钙黄绿素1 μL、终浓度1.6 μmol/L的FIP和BIP各1 μL、终浓度0.2 μmol/L F3和B3各1 μL、终浓度0.4 μmol/L LoopF和LoopB各1 μL，无菌去离子水补足25 μL。LAMP反应条件：63 ℃温育1 h，之后80 ℃下灭活5 min。在LAMP反应体系反应过程中，每间隔1 min读取一次荧光，收集荧光信号。
反应结果判断根据实时扩增曲线和荧光染料目测观察评估检测结果：实时荧光扩增曲线检测。其中，收集到荧光信号，扩增曲线呈“S”形为阳性，未收集到扩增荧光信号的呈直线型为阴性；
染料颜色反应检测。在LAMP反应体系中，加入1 μL钙黄绿素荧光染料(Loopamp FD)，反应结束后，肉眼观察反应液呈绿色荧光的为阳性，反应液呈橙色的为阴性。
LAMP检测体系和反应条件的优化：在反应初始体系的基础上，对关键因素Mg2+、dNTP、甜菜碱和Bst DNA聚合酶的浓度进行一系列优化；
对反应条件包括温度和时间进行优化。各单因素处理试验，在其他成分用量及条件不变的情况下，分别将dNTPs设为0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mmol/L共6个终浓度梯度；
Mg2+设为4，6，8，10，12 mmol/L共5个终浓度梯度；
甜菜碱设为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L共7个终浓度梯度；
BstDNA聚合酶设为40，80，160，320，340 U/mL共5个终浓度梯度。反应条件优化：按以上优化好的反应体系进行反应，反应温度设置为63，65，67 ℃进行LAMP反应；
实时扩增曲线出峰最早的时间即为最佳反应时间。上述单因素试验，均以灭菌ddH2O为模板作为阴性对照。反应结束后，通过实时扩增曲线和荧光显色双重结果，确定最佳成分终浓度。
1.2.4 LAMP对草莓白粉病菌特异性验证 以草莓白粉病菌及12个对照菌株(甜瓜白粉病菌、辣椒白粉病菌、番茄白粉病菌、葡萄霜霉病菌、黄瓜霜霉病、甜瓜白粉病菌、草莓根腐病菌、草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌、黄瓜多主棒孢菌、番茄灰叶斑病菌和萝卜黑斑病菌)的DNA为模板，利用上述建立优化的LAMP检测体系，在最佳温度条件下进行LAMP扩增。根据实时扩增曲线与反应液体荧光显色相结合的方法评估LAMP检测体系的特异性。
1.2.5 LAMP和普通PCR对草莓白粉病菌检测灵敏度对比 草莓白粉病菌DNA快速提取后测定浓度为3.2 ng/μL，用无菌超纯水将原液DNA按10倍系列稀释至10-6。以不同质量浓度的草莓白粉病菌DNA 2 μL为模板进行LAMP灵敏度试验，以去离子水代替DNA模板作为阴性对照，利用建立的LAMP最佳反应体系和反应条件进行扩增，待LAMP反应结束后，采用实时荧光扩增曲线和荧光染料目测观察法双重结果确定LAMP检测的灵敏度。实时荧光扩增检测结果：呈“S”形为阳性，呈直线为阴性；
荧光染料目测结果：观察到绿色荧光为阳性，橙色为阴性。
应用普通PCR 扩增检测系列稀释浓度的草莓白粉病菌DNA(与LAMP检测的DNA浓度一致)，反应体系为 25 μL：Taq PCR Master 混合物 12.5 μL，ITS1和ITS4引物各 1 μL，1.0 μL 模板 DNA，用灭菌水补足体系至 25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 90 s，35 个循环；
72 ℃延伸 10 min。取3 μL PCR 扩增反应产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察扩增条带大小。
1.2.6 草莓白粉病菌LAMP检测方法重复性验证 在天津市武清区草莓温室(该温室为草莓白粉病自然发病病圃，草莓白粉病发病严重，发病率在70%以上，整个生育期未进行药剂防控)采集感染白粉病的草莓叶片、果实及果柄各5份作为阳性样本；
在天津市汉沽草莓温室(该温室肥水管理良好，前期药剂预防较好，几乎未见草莓白粉病发生)采集健康未发病的叶片、果实及果柄各5份作为阴性样本；
去离子水3份作为阴性对照。对发病组织进行1.2.1中快速全基因组DNA提取，通过1.2.4中建立的LAMP检测方法验证其重复性及可靠性。
1.2.7 利用建立的LAMP可视化检测方法对田间草莓样品进行检测 应用已建立的草莓白粉病LAMP检测方法对天津市农业科学院武清基地草莓试验温室的草莓白粉病菌进行现场检测。
样本采集方法：对植株不同部位、不同发病程度的样本进行采集。
分别采集发病很轻(仅叶片背面出现褪绿斑，病斑上未见白色霉层)、较轻(叶背病斑处有少量、稀疏的白色霉层)和严重(叶片正面和背面病斑处已产生大量、厚密的白色霉层)3种发病程度的叶片各5片，取健康叶片5片作为阳性对照。
分别采集发病很轻(果实略有畸形，但未见任何病斑及白色霉层)、较轻(果实表面有少量稀疏的霉层)和严重(整个果实软烂已被白色霉层包裹)3种发病程度的果实各5个，健康新鲜的果实5个作为阳性对照。
果柄分别采集了发病较轻(果柄处未见白色霉层，但已出现红褐色)、较重(果柄表面有少量稀疏霉层)及严重(整个果柄已被白色霉层覆盖)3种发病程度的样本各5份，取健康未发病的果柄5份作为阳性对照。
对采集的病组织样本进行DNA快速提取，并应用优化建立的草莓白粉菌LAMP检测方法进行检测。
2.1 草莓白粉病菌LAMP检测体系的优化
2.1.1 dNTPs终浓度的优化 实时扩增曲线结果显示(图1-A)，随着dNTPs终浓度的增加，扩增开始时间越早，峰值度越高，说明扩增后的模板DNA浓度越高。当dNTPs终浓度为1.6 mmol/L时，扩增效率最优，dNTPs终浓度为0.8 mmol/L和阴性对照在1 h内均未扩增出曲线。
荧光染料显色结果表明(图1-B)，肉眼观察终浓度为1.0～1.8 mmol/L均呈绿色，其中1.4～1.8 mmol/L的荧光绿色相对其他颜色较深，而0.8 mmol/L和阴性对照呈橘色，结合双重判定结果，确定dNTPs最佳终浓度为1.6 mmol/L。
A.实时荧光曲线结果；
B.反应液荧光显色结果(编号1—6分别为dNTPs终浓度0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mmol/L；
N为阴性对照)。
2.1.2 Mg2+终浓度的优化 如图2所示，Mg2+终浓度为6～12 mmol/L均能扩增出典型的S曲线，其中8 mmol/L扩增的检测时间最短，效率最高，而Mg2+终浓度为4 mmol/L未出现S曲线，检测结果呈阳性(图2-A)；
荧光显色结果表明，Mg2+终浓度为6 mmol/L～12 mmol/L呈荧光绿色，而处理4 mmol/L和阴性对照呈橘色，综合判定最佳Mg2+终浓度为8 mmol/L(图2-B)。
A.实时荧光曲线结果；
B.反应液荧光显色结果(编号1～5分别为Mg2+终浓度4，6，8，10，12 mmol/L；
N为阴性对照)。
2.1.3 甜菜碱浓度优化结果 实时扩增结果显示(图3-A)，甜菜碱不同终浓度处理对扩增开始时间影响不大，终浓度为0～1.2 mmol/L均能扩增出明显的“S”形曲线，而终浓度为1.2 mmol/L纵坐标表现出更强的荧光信号；
荧光染料可视结果表明(图3-B)，7个终浓度处理均呈荧光绿色，阴性对照为橘色，与扩增曲线结果相应证，最终确定甜菜碱最佳终浓度为1.2 mmol/L。
2.1.4 BstDNA聚合酶浓度优化结果 实时扩增结果显示(图4-A)，BstDNA聚合酶终浓度为40～340 U/mL均能扩增出明显的“S”形曲线，并随着终浓度的增加，扩增开始时间越早，其中终浓度为320 U/mL和340 U/mL出现曲线时间接近，扩增效率相当。
荧光染料可视结果表明(图4-B)，5个终浓度处理均呈荧光绿色，阴性对照为橘色，与扩增曲线结果相一致，最终确定BstDNA聚合酶最优终浓度为320 U/mL。
2.1.5 反应温度的优化结果 实时扩增结果显示(图5-A)，在63，65，67 ℃温度条件下，均能出现扩增曲线，其中65 ℃扩增曲线出现的时间最早，扩增效率最高；
荧光染料可视结果表明(图5-B)，3个温度处理后均呈绿色荧光，65 ℃呈现的颜色更深更亮，阴性对照为橘色，最终确定65 ℃为最优反应温度。
A.实时荧光曲线结果；
B.反应液荧光显色结果(编号1～7分别为甜菜碱终浓度0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L；
N为阴性对照)。
A.实时荧光曲线结果；
B.反应液荧光显色结果(编号1～5分别为BstDNA聚合酶终浓度40，80，160，320，340 U/mL；
N为阴性对照)。
2.1.6 优化后的LAMP检测体系 根据以上结果LAMP检测优化反应体系(25 μL)：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL、终浓度为8 mmol/L的MgSO41.5 μL、终浓度为1.6 mmol/L的dNTPs 4.0 μL、终浓度为1.2 mmol/L的甜菜碱0.6 μL、终浓度为320 U/mL的BstDNA聚合酶1 μL、DNA模板2.0 μL、钙黄绿素1.0 μL、终浓度为1.6 μmol/L的FIP和BIP各1 μL，终浓度为0.2 μmol/L的F3和B3各1 μL，终浓度为0.4 μmol/L的LoopF和LoopB各1 μL，无菌去离子水补足25 μL。LAMP反应条件：65 ℃温育1 h，之后80 ℃下灭活5 min。在LAMP反应体系反应过程中，每间隔1 min读取一次荧光，收集荧光信号。
A.实时荧光曲线.；
B.反应液荧光显色结果(编号1～3分别为温度63，65，67 ℃；
N为阴性对照)。
2.2 草莓白粉病菌LAMP特异性检测
实时扩增结果显示(图6-A)，引物组在近30 min时仅对草莓白粉病菌呈现出实时扩增的“S”形曲线，其他病原菌和阴性对照均未扩增出曲线；
荧光显色观察结果显示(图6-B)，只有草莓白粉病菌DNA为模板的EP管液体呈现绿色荧光，说明样品中检测到草莓白粉病菌，其他病原菌和阴性对照均为橘色，说明样品中没有草莓白粉病菌。这说明本试验设计的LAMP引物组可以将草莓白粉病菌与其他病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于草莓白粉病菌的检测与鉴定。
2.3 草莓白粉病菌检测灵敏度测定
2.3.1 LAMP检测灵敏度测定结果 LAMP扩增灵敏度检测结果表明(图7)，3.2，3.2×10-1，3.2×10-2，3.2×10-3，3.2×10-4ng/μL质量浓度的草莓白粉病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光，实时荧光扩增曲线呈典型的“S”形，其他浓度及阴性对照显色结果为橙色，且实时扩增为直线形。说明所设计的草莓白粉病菌引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB通过优化后的LAMP扩增，对草莓白粉病菌的检测灵敏度可达3.2×10-4ng/μL。
A.实时荧光曲线结果；
B.反应液荧光显色结果(编号1为草莓白粉病菌；
2～7依次为对照菌株辣椒白粉病菌、黄瓜白粉病菌、草莓灰霉病菌、草莓根腐病菌、草莓炭疽病菌、草莓蛇眼病菌；
N为阴性对照)。
A.实时荧光曲线结果；
B.反应液荧光显色结果(编号1～7草莓病原菌粗体DNA浓度依次为3.2，3.2×10-1，3.2×10-2，3.2×10-3，3.2×10-4 ，3.2×10-5，3.2×10-6 ng/μL；
N为阴性对照)。
2.3.2 普通PCR灵敏度测定 从图8可以看出，稀释后的系列浓度3.2×10-6～3.2×10-1ng/μL DNA进行PCR 扩增后，可以清楚地判断出靶标目的片段的有无，其中3.2×10-1，3.2×10-2ng/μL能检测到明显的条带，而3.2×10-6～3.2×10-3ng/μL检测不到条带，说明普通PCR最低检测限为3.2×10-2ng/μL。
图8 草莓白粉病菌普通PCR扩增灵敏度的检测结果Fig.8 Detection results of sensitivity of strawberry powdery mildew by using PCR amplification
2.4 草莓白粉病菌LAMP检测方法重复性验证结果
反应体系65 ℃温育60 min后直接观察反应液颜色变化，结果显示(图9)，所有感染白粉病的阳性样本均能被荧光染料染色，呈现明显的绿色荧光，而所有健康的阴性样本及阴性对照样本均显现为橙色，表明未被草莓白粉菌感染，此结果与采集时预先了解的发病情况和健康情况一致，证明上述建立的草莓白粉病LAMP检测方法是可靠的，并且有很好的重复性。
1.叶片(发病轻)；
2.果实(发病轻)；
3.果柄(发病较轻)；
4.叶片(发病严重)；
5.果实(发病严重)；
6.果柄(发病严重)；
7.健康果实。
2.5 利用建立的LAMP可视化检测方法对田间草莓样品的检测结果
对采集的病组织样本进行DNA快速提取，并应用优化建立的草莓白粉病菌LAMP检测方法进行检测，结果表明(图10)，草莓叶片、果实和果柄不同采样部位及不同发病程度的样本在LAMP体系检测60 min内均显现为绿色荧光，说明采集的病叶、果实和果柄均受到不同程度的侵染；
对于发病不明显、未表现出白粉霉层典型症状的样本也能准确检测出白粉病菌的存在。如发病很轻的叶片，仅在叶背面有褪绿病斑，或者发病轻的草莓果实，仅有轻微畸形，组织表面没有表征白粉病霉层的任何特征，此时只是根据经验判断是草莓白粉病初期，而经过LAMP快速检测可以清楚地判断其已被草莓白粉病菌侵染和危害；
健康叶片及阴性对照荧光染色后为橘色，说明健康叶片和阴性对照未感染草莓白粉病菌，与实际样本情况相符合。
1～7为草莓叶片样本：1.发病很轻叶片，2，3.发病较重，4，5.发病严重，6，7.健康叶片；
8～14.草莓果实样本：8，9.发病较轻，10.发病较重，11，12.发病严重，13，14.健康果实；
15～21.草莓果柄样本：15.发病较轻，16，17.发病较重，18，19.发病严重，20，21.健康果柄。
草莓白粉病俗称白毛病，是草莓生产上发生普遍的一种病害，尤其是在保护地草莓栽培中发生严重。草莓白粉病一旦发生很难彻底根除，常会造成草莓产量降低、品质下降[13]。目前，白粉病的诊断主要通过白色霉层人工检验，而未见白色霉层之前所表现的一系列症状(如叶片背面出现褪绿斑，果柄、花瓣变为红褐色或者果实略有畸形等)均可能是草莓白粉病菌潜伏侵染的早期症状，再加上草莓白粉病专性寄生的特点不能进行人工培养鉴定，经常导致该病防治滞后，难以达到理想的防治效果。因此，针对草莓白粉病菌开发一种快速、准确的检测方法，对于病害的早期有效识别和及时防治至关重要。
近年来，分子生物学技术为病原菌检测及鉴定提供了新的手段，为病原菌的早期诊断提供了精准的预测和预报[14]。目前，国内外学者已经开展了一些草莓病害病原菌的分子检测，方法多为普通PCR检测，如Rigotti等[15]采用PCR检测技术对草莓灰霉病菌进行了鉴定；
王楠[16]开发的三重PCR 检测，可在田间、植株上同时检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌3种病原菌；
刘雅等[17]应用建立的RT-PCR 技术对上海地区137份样本4种病毒进行了分析检测，但该方法需要的设备昂贵，更适宜在实验室进行操作。环介导等温扩增技术因其恒温操作而具有现场检测的条件，同时也具有快速、准确的优点，目前，已经成为检测病原微生物的重要分子工具。而在草莓病害方面运用LAMP扩增技术检测较少，仅在草莓轻型黄边病毒病、枯萎病及炭疽病上进行了应用[18-19]。本研究建立了草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测体系，通过实时荧光曲线与荧光显色肉眼识别相结合的方法，对体系中主要成分进行优化，其中Mg2+终浓度为8 mmol/L、dNTPs终浓度为1.6 mmol/L，甜菜碱终浓度为1.2 mmol/L，BstDNA聚合酶终浓度为320 U/mL，靶标菌DNA最低检测浓度为3.2×10-4ng/μL，65 ℃温育1 h内完成检测，浓度较高的靶标DNA在25 min左右即可完成检测。
为了避免假阳性的出现，本研究在体系优化的过程中加入钙黄绿素荧光染料，应用荧光定量PCR仪的VIC通道，每间隔1 min读取一次荧光，收集荧光信号，扩增曲线呈“S”形为阳性，未收集到扩增荧光信号的，呈直线型为阴性；
反应结束后，肉眼观察反应液，呈绿色荧光为阳性，显橙色为阴性，整个LAMP反应过程中和反应结束后无需开盖，减少了在空气中暴露的时间，降低了假阳性的出现。而前人报道的LAMP检测方法多是反应后加入荧光染料显色，或是反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测的验证，这期间避免不了开盖，而LAMP极强的扩增效率，会导致实验室气溶胶污染出现假阳性[20-21]。因此，采用荧光定量PCR仪实时曲线监测、结合LAMP反应结束后反应液荧光显色直接观察双重判定结果的方法，对于草莓白粉病菌LAMP体系最佳成分及条件的筛选更加精准、稳定。
本研究在检测过程中，DNA采用快速提取的方法，DNA的浓度不是很高，但是应用建立的LAMP体系仍能检测出来，检测的最低限浓度为3.2×10-4ng/μL，与普通PCR相比，LAMP的检测效率是普通PCR的100倍。该结论再次证明，LAMP的检测灵敏度较高，明显高于普通PCR的检测效率。陈柳等[18]应用优化RT-LAMP 方法能快速、特异地检测草莓轻型黄边病毒，比RT-PCR方法检测的灵敏度高100倍，这与本研究LAMP灵敏度的检出效率相一致。此外，笔者在田间新采集的样本检测中初步验证了草莓白粉病菌LAMP可视化的检测效果。将样本进行DNA快速提取15 min左右，模板DNA加入建立的草莓白粉病菌LAMP检测体系中，保持65 ℃温育60 min后，通过体系反应液显色直接判断靶标病原菌的有无，初步验证了该方法对于草莓白粉病田间样本检测的高效性。未来，笔者将进一步验证该方法在田间现场检测的准确性和高效性，形成轻简化的试剂盒，为草莓产区、相关企业、基层推广部门进行草莓白粉病的预警预报提供高效便捷的检测手段，为草莓白粉病的科学防控奠定重要基础。
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