付 杰，宋 伦，于旭光，宋广军，王 昆，刘 印，刘苏萱
(1.辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋生物资源与生态学重点实验室,辽宁大连 116023; 2.大连海洋大学,辽宁大连 116023)
辽宁丹东鸭绿江口海域是菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的主要增养殖区，2020年贝类养殖面积为4.5万hm2，产量为24万t，占辽宁省菲律宾蛤仔总产量的20%、占全国的6%，对渔业碳汇贡献较大[1-2]。但近两年发现菲律宾蛤仔出现肥满度降低、生长周期延长、种质退化、病害增多和死亡率升高等现象，引起了养殖企业和科研工作者的关注[3]。初步分析，上述现象应为内因(种质退化)和外因(生态演变)共同作用。有学者发现，滤食性贝类对饵料微藻粒径大小有摄食选择性，而海洋微藻有小型化和甲藻化趋势[4-6]。宋广军等[7]利用全粒级微藻生物量测算2012年鸭绿江口海域贝类养殖容量为春季1 480 g·m-2、夏季320 g·m-2、秋季1 100 g·m-2。张雪等[8]利用大粒级微藻(粒径>10μm)生物量测算2019年黄海北部菲律宾蛤仔养殖容量为春季100 g·m-2、夏季34 g·m-2、秋季63 g·m-2，修正的养殖容量明显偏低，同时研究发现，黄海北部海域微藻粒级偏小，春、夏、秋季大粒级微藻生物量占比分别为(39±10)%、(35±14)%、(38±11)%。饵料微藻供应能力春季最高，秋季次之，夏季最低。对于滤食性贝类，饵料基础中实际被利用的那一部分即是供饵力，其对揭示贝类营养能量及免疫水平至关重要。而有效饵料微藻(大粒级藻类)的比例、总量及存在周期可反映滤食性贝类增养殖区的供饵力水平。
过往研究微藻粒级结构主要利用叶绿素a分级法对微藻生物量进行粗略区分[9-12]，由于大孔径滤膜截留率较高导致小粒级微藻的贡献被严重低估，而高估了大粒级微藻(粒径>10μm)即有效饵料的贡献，进而会使研究区内的贝类养殖容量被高估。随着高通量测序-分子鉴定技术的发展，通过真核微藻分子鉴定获取的序列数可极大提高小粒级微藻的检出率，用于微藻全粒级结构的统计分析，可客观表征有效饵料微藻生物量大小。本文采用该技术对鸭绿江口海域16个站位的微藻粒级结构进行了逐月研究，采用反距离权重插值模型进行了饵料微藻供饵力分布图绘制，同时测算了该海域贝类养殖容量，以期对鸭绿江口菲律宾蛤仔可持续健康增养殖提供技术指导。
1.1 研究海域与采样站位
2020年，在丹东东港鸭绿江口海域垂岸布设16个站位(图1)，于3—12月每个月采集1次海水过滤样品，鉴定真核微藻种类、检测叶绿素a含量。每个站位采集表层海水1 L，首先现场用200 μm筛绢过滤去除大型浮游生物，然后用0.22 μm微孔滤膜收集全部微藻，最后将滤膜转移至1.5 mL无菌离心管中，置于-80 ℃冷冻保存、运输，用于真核微藻分子鉴定，同期进行叶绿素a指标监测。调查、检测和质量控制方法均参照《海洋调查规范》(GB/T 12763—2007)[13]和《海洋监测规范》(GB 17378—2007)[14]执行。
图1 采样站位示意
1.2 分析方法
1.2.1 饵料微藻分子鉴定
提取滤膜上真核微藻宏基因组18S rDNA，检测18S rDNA浓度及纯度，提取采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)，利用SEQ ID NO.1～2所述的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物，以提取的18S rDNA为模板，进行可变区V4的PCR(聚合酶链式反应)扩增，对于PCR扩增引物，构建DNA文库，对于构建的文库，使用Hiseq2500 PE250模式进行上机测序，测序得到的原始数据经拼接、截取、过滤，得到可操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)，使用 Uparse 软件(http://drive5.com/uparse/)对有效数据进行聚类和物种分类，采用朴素贝叶斯分类方法与数据库(https://www.arb-silva.de/,Version 108)对OTUs代表序列进行物种注释[15]，最终得到微藻注释信息[2]。
1.2.2 数据分析
由于不同真核生物中rDNA的拷贝数差异较大，因此rDNA扩增子测序所获的序列数并不能表征环境样本中真核微藻的丰度[16-17]，但相关研究发现，rDNA序列多态性与细胞中rDNA的拷贝数成正比，而真核微藻细胞体积与rDNA的拷贝数成正比，因此，真核微藻分子鉴定获取的序列数可表征其生物量大小，用于微藻全粒级结构研究是可行的[16-18]。将16个站位所获得的优势度超过0.1%的种类均作为整体优势种参与粒级生物量比例统计，参照相关文献将筛查出的优势种粒径按微微型(<3 μm)、微型(3～20 μm)、小型(>20 μm)进行筛检分级[16-22]，研究微藻粒级结构，同时由于大部分滤食性贝类对10 μm以上饵料微藻截留效率较高[6]，为研究微藻对贝类的供饵能力，再将优势种按粒径大小划分为2组，即大粒级(>10 μm)和小粒级(<10 μm)。根据各粒径真核微藻序列数占比统计其粒级组成结构，同时利用其序列数占比和总叶绿素a含量测算某种粒级微藻的叶绿素a含量，计算公式[8]：
(1)
式(1)中，DBi为某粒径微藻的叶绿素a浓度，单位：μg·L-1；
NBi为总叶绿素a浓度，单位：μg·L-1；
DC为某粒径微藻的序列数；
NC为所有微藻的序列数。
物种生物量优势度(Y)表示微藻群落中某一物种质量所占的优势程度[4]：
(2)
式(2)中，ni为第i种微藻种类的OTUs数，N为OTUs总数，fi为第i种微藻种类在各样品中出现的频率。
由于菲律宾蛤仔对大粒级饵料微藻摄食效率较高，根据供饵力含义，即有效饵料微藻供应能力，本文供饵力指数(Ai)专指大粒级微藻生物量与其占比乘积[8]：
Ai=Bi·Ci%
(3)
式(3)中，Bi为第i站位大粒级微藻生物量，Ci%为第i站位大粒级微藻占比。
根据PARSONS-TAKAHASHII营养动态模型对东港鸭绿江口海域菲律宾蛤仔养殖容量进行估算，利用海域初级生产者微藻的生产量和生态效率，估算菲律宾蛤仔的现存生物量[23]。
Q=(BEn)·k
(4)
式(4)中，Q为贝类的生物量；
B为微藻的生物量；
E为生态效率；
n为贝类营养阶层；
k为贝类带壳鲜质量与软组织鲜质量比值。
1.2.3 插值方法
鸭绿江口海域月际及平均供饵力分布图采用反距离权重(inverse distance weight,IDW)模型进行空间插值，即以16个站位供饵力指数的测算值推算未测海域供饵力指数，不同站位的供饵力指数对距它不同远近的点影响大小不同，距离越近影响越大。而且IDW插值计算有高效、便捷等诸多优点，常被用于生态环境评价中。供饵力指数插值计算结果仅跟周边监测点的样本数据有关，插值过程中，还要顾及采样数据的空间异质性。计算模型如下：
(5)
式(5)中，Z(x)为插值结果，待插值点的属性值；
zi为监测站位供饵力指数；
Di为监测站位与待插值点之间的欧氏距离；
n为幂指数；
m为参与插值运算的监测站位数。
对上述公式计算、数据分析、分布图均通过WPS Office、SPSS 22.0、ArcGIS软件完成。
2.1 微藻粒级结构
为了解鸭绿江口海域微藻粒径结构分布规律，按照微藻粒级分级习惯，方便与之前和之后的研究结果进行对比，对微藻粒径按微微型、微型、小型进行生物量占比分析(表1)，并用饼状图大小代表各站位微藻生物量(图2)。微型微藻在春、夏季占优势，小型微藻在秋、冬季占优势，而微微型微藻只在春、夏季生物量较高，秋、冬季生物量极低。其中位于11号站位总生物量最多，微型微藻在各站位占比均较高。
图2 鸭绿江口海域微藻粒级分布图
表1 鸭绿江口各月份微藻粒级分布
2.2 贝类供饵力分布
由于滤食性贝类对大粒级微藻(>10 μm)利用率较高，通过对微藻粒径重新划分，发现大粒级微藻基本为微型微藻和小型微藻。鸭绿江口海域大粒级饵料微藻生物量春季占20%、夏季占29%、秋季占63%、冬季占56%，在秋、冬季占优势；
小粒级微藻(<10 μm)生物量春季占80%、夏季占71%、秋季占37%、冬季占44%，在春、夏季占优势。每个月供饵力指数平均数的分布规律见图3，根据数值分布供饵力指数可划分3个级别，其中高供饵力组平均指数>6，中供饵力组平均指数在3～6，低供饵力组平均指数<3。春、秋季供饵力较高，分别在4月和10月形成2个高峰(图4)。
图3 鸭绿江口海域供饵力指数月际站位分布
图4 鸭绿江口海域供饵力指数月际变化
鸭绿江口海域平均供饵力指数平面分布见图5。各月份供饵力空间分布不尽相同，整体来看，鸭绿江口海域月际整体处于中供饵力水平，其中，10月供饵力最高，7月供饵力最低。
图5 鸭绿江口海域平均供饵力指数分布图
鸭绿江口海域供饵力指数与环境因子关联性见图6。在空间尺度上，鸭绿江口东侧海域(1～6#站位)供饵力指数与叶绿素a、溶解氧、无机氮磷比正相关，与盐度负相关；
中部海域(7～10#站位)供饵力指数与叶绿素a、无机氮、硝酸盐、总氮正相关，与盐度负相关；
西侧海域(11～16#站位)供饵力指数与叶绿素a、无机氮磷比、无机氮、硝酸盐、总氮正相关，与盐度负相关。总体而言，空间尺度上，鸭绿江口海域供饵力指数与叶绿素a、无机氮磷比、无机氮、硝酸盐、总氮正相关，与盐度负相关(图6-A)。
在时间序列上，各站位供饵力指数4、12月受环境因素影响最多，主要受总氮、总磷、COD、无机磷、硅酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、无机氮、有机氮、叶绿素a正向影响，受pH、溶解氧、无机氮磷比负向影响(图6-B)。
图6 供饵力指数与环境因子关联(*P≤0.05，**P≤0.01)
2.3 贝类养殖容量估算
由于大部分滤食性贝类对10 μm以上饵料微藻截留效率较高[6,24-25]，参照PARSONS-TAKAHASHII营养动态模型[11]，利用10 μm以上粒级微藻生物量估算菲律宾蛤仔养殖容量。图7显示，鸭绿江口海域月际实际可承载菲律宾蛤仔养殖容量为41～338 g·m-2，平均为195 g·m-2。其中，春季为248 g·m-2、夏季为117 g·m-2、秋季为262 g·m-2、冬季为67 g·m-2，贝类养殖容量主要为春、秋季的贡献。其中10月份最高，5月份次之。
图7 基于大粒级微藻生物量估算的月际贝类养殖容量
宋伦等[26]研究发现，2019年黄海北部鸭绿江口临近海域(靠近10号站位)春季(5月)微型微藻生物量占比最大，秋季(10月)小型微藻生物量占比最大，本研究结果与其一致。但2019年夏季(8月)微微型微藻生物量占比最大，2020年则为微型微藻占比最大，出现差异的原因是优势种发生改变，2019年夏季鸭绿江口临近海域(靠近10号站位)第一优势种为青绿藻(Mamiellagilva)，第二优势种为剧毒卡罗藻(Karlodiniumveneficum)。LIU等[30]研究发现，鸭绿江口海域菲律宾蛤仔主动选择摄食微型微藻，避食微微型微藻，但秋、冬季对微微型微藻的选择性指数相对春、夏季较高，对于微藻类群，菲律宾蛤仔避食硅藻、金藻、隐藻，主动选择甲藻、绿藻。本研究区域剧毒卡罗藻(Karlodiniumveneficum)生物量较高，该种为微型甲藻，也是供饵力主要贡献微藻，可能会影响贝类卫生质量安全。剧毒卡罗藻是一种有毒甲藻，近年来在我国沿海海域已经暴发过赤潮。营养盐作为微藻生长的基础，对鸭绿江口海域全年的优势种剧毒卡罗藻毒性也起调控作用，有研究发现，高浓度氮可刺激剧毒卡罗藻的毒性作用，随着氮浓度的升高，毒力也逐渐增强[31-32]，本研究区域为菲律宾蛤仔的主要增养殖区，养殖面积为4.5万hm2，年产量为24万t，占辽宁省菲律宾蛤仔总产量20%、占全国6%，贝类卫生质量安全应引起重视[33-35]。
利用叶绿素a分级法研究发现[27]，2016年夏季(8月)鸭绿江口邻近海域微藻以大粒级(小型)为主(55%)，小粒级(微微型)次之(28%)，中粒级(微型)最少(17%)，本文高通量测序-分子鉴定分级法研究结果与其差异较大。叶绿素a分级法由于大孔径滤膜截留率较高导致小粒级微藻的贡献被严重低估，SONG等[28]利用分子鉴定微藻粒级分级法和叶绿素a分级法对比结果显示，同一种微藻在分级滤膜上均有检出，在不同滤膜上截留率不同，不同种类在同一滤膜上截留率也有所差异，微微型浮游植物在20 μm和3 μm滤膜上的截留率均较高，在20 μm滤膜上最高截留86.2%，在3 μm滤膜上最高截留99.5%，分子鉴定分级法修正结果显示，辽东湾四季微微型浮游植物占有绝对优势，其次是微型浮游植物，相反，粒径较大的小型浮游植物总生物量贡献率四季始终最低，叶绿素a分级法对微微型浮游植物的测算误差春季最高达到(82±8)%。孙军等[29]对显微测量粒径分析、叶绿素a分级、电子粒度分析仪这3种浮游植物粒级结构研究方法进行了分析比较，发现使用叶绿素a分级法、电子粒度分析仪法会低估小粒径种类，20 μm孔径的筛绢对微型浮游植物的截留率高达85.63%，显微测量粒径分析修正后<20 μm的浮游植物(微微型+微型)组分占82.27%，分子鉴定技术极大的提高了小粒级微藻检出率，为微藻粒级研究提供了新思路。
影响供饵力指数的正相关环境因子主要为氮、磷、硅等营养元素，尤其是无机氮、磷影响更为显著，而有机氮、磷影响相对较小，可能是无机氮、磷的输入提高了大粒级微藻的占比和生物量[25-26]。当然，微藻供饵力指数可能还受浮游动物等上级食物网的下行控制影响[36]，今后需要应加强关注。
本文对该海域菲律宾蛤仔养殖容量评估结果低于之前的测算结果进行了评估[7]，主要是对用于评估的营养动态模型中微藻生物量参数进行了优化，筛选了可被贝类利用的大粒级微藻生物量进行测算，使得贝类养殖容量测算结果偏低，但更加符合实际。另外，近些年也可能由于微藻粒级结构发生变化，粒级变小，导致实际的贝类养殖容量降低，另外，各营养级生物群落间相互影响等还需后续继续研究[37-38]。
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