王莹，李锋涛，黄美子，陈毓，卢军锋，杨雨欣，钱建中
(江苏农牧科技职业学院动物药学院，江苏 泰州 225300)
黄精为百合科黄精属植物，其干燥根茎为临床常用大宗中药材，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效。黄精是传统的药食同源类中药，现代研究表明，黄精除用于治疗脾胃虚弱、干咳少痰、精血不足等症，还具有降血压、防止动脉粥样硬化、延缓衰老等作用[1-2]。黄精的主要成分有多糖、生物碱、氨基酸等。黄精多糖作为黄精的主要活性成分之一，具有增强免疫功能、抑菌抗炎、调节血糖血脂等药理作用。目前，国内对黄精多糖的研究主要集中在降血糖药物和畜禽免疫增强剂方面[3-5]。Xie等[5]研究发现，黄精多糖对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，降糖效果好。赵谨等[6]研究表明，黄精多糖能通过提高雏鸡的抗氧化能力，提高血清中免疫球蛋白含量，提高胸腺、法氏囊和脾脏的免疫功能等途径来发挥免疫调节作用，维持机体免疫系统稳态。
近年来，国内多采用水提醇沉法[7]、微波辅助法[8]、超声波辅助法[9]、酶辅助提取法[10]等提取多糖。且已有学者研究了黄精多糖的提取工艺，但普遍存在着多糖得率较低的问题[11]。李志涛等[8]采用微波辅助法提取黄精多糖，通过单因素试验对影响黄精多糖得率的物料粒度、料液比、微波辐照功率、辐照时间进行探讨，确定最佳工艺参数下黄精多糖的得率仅为10.57%；
林志銮等[9]采用超声波辅助法提取粗多糖，黄精多糖含量为108.57 mg/g；
张梓原等[12]比较了水提醇沉法和复合酶法两种不同提取工艺对黄精多糖得率的影响，研究发现，复合酶法得到的多糖得率远高于水提醇沉法的多糖得率。为了进一步提高黄精多糖得率，本文拟采用超声辅助复合酶法提取黄精多糖，考察液料比、加酶量、超声功率以及酶解pH值对黄精多糖得率的影响，通过响应曲面法优化其工艺参数；
同时研究黄精多糖的体外抗氧化活性，为黄精多糖的开发和利用提供了参考依据。
1.1 药品与试剂
黄精，购自安徽亳州千草药业有限公司，60 ℃下真空干燥，经多功能粉碎机粉碎，过80目筛，所得黄精粉末密封贮藏，备用；
葡萄糖对照品购自中国食品药品检定研究院；
维生素C(VC)购自上海生工生物工程有限公司，纤维素酶(1.1×105U/g)购自和氏璧生物科技有限公司；
果胶酶(5×104U/g)购自和氏璧生物科技有限公司；
其余均为市售分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 葡萄糖标准曲线绘制
以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸显色法测定多糖浓度，以吸光度(y)为纵坐标，葡萄糖浓度(x)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线[7]。
1.3 黄精多糖的提取及测定
称取10 g黄精粉末于500 mL具塞锥形瓶中，按照一定的液料比加入一定pH值的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，混匀，加入适量的纤维素酶与果胶酶，50 ℃酶解，放入超声清洗器中以一定的功率处理30 min，热水浸提，抽滤，收集滤液，旋转浓缩，加入足量乙醇溶液，4 ℃醇沉过夜，4 000 r/min离心15 min得沉淀，干燥后即得黄精粗多糖样品。
将黄精粗多糖用蒸馏水溶解，定容至250 mL，精密量取1 mL 黄精多糖溶液于250 mL 容量瓶中，加入5%苯酚水溶液1 mL、摇匀后加入5 mL浓硫酸，定容，摇匀，静置30 min，在490 nm 处测定吸光度，根据下列公式计算黄精多糖得率。
式中：m为黄精粉末的质量(mg)；
A490为稀释后的多糖溶液的吸光度；
前一个250为稀释倍数；
后一个250为黄精多糖溶液体积(mL)。
1.4 单因素试验
在酶添加量1.5%(m纤维素酶∶m果胶酶=1∶1)，超声功率320 W，酶解pH值 5.0条件下，考察不同液料比(mL/g)5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1对黄精多糖得率的影响；
在液料比20∶1，超声功率320 W，酶解pH值5.0条件下，考察酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对黄精多糖得率的影响；
在酶添加量1.5%(m纤维素酶∶m果胶酶=1∶1)，液料比20∶1，酶解pH值 5.0条件下，考察超声功率(240、280、320、360、400 W)对黄精多糖得率的影响；
在酶添加量1.5%(m纤维素酶∶m果胶酶=1∶1)，液料比20∶1，超声功率320 W条件下，考察酶解pH值(3、4、5、6、7)对黄精多糖得率的影响。以上每个试验均平行测定3次。
1.5 响应面优化黄精多糖提取工艺
根据单因素分析结果，以液料比(A)、加酶量(B)、超声功率(C)、酶解pH值(D)为自变量，以黄精多糖得率为响应值(Y)，采用Box-benhnken试验设计法进一步优化黄精多糖提取工艺。分析因素及水平编码表见表1。
表1 响应面试验分析因素与水平
1.6 黄精多糖抗氧化作用试验
1.6.1 DPPH自由基清除能力测定
参照Shimada等[13]的方法并进行适当改进，配制 0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mg/mL 黄精多糖水溶液，准确移取0.20 mL 不同浓度的黄精多糖水溶液于比色管中，加入预先配置好0.15 mmol/L DPPH 甲醇溶2 mL液，摇匀后暗处放置30 min，以样品溶剂为空白，测定其上清液515 nm波长处吸光度 A，同时测定样品溶液在 515 nm 处的吸光度 A0及 DPPH 甲醇溶液在 515 nm 处的吸光度A1[7]，VC作为阳性对照，平行测定3次，求平均值。按下式计算黄精多糖DPPH自由基清除率。
1.6.2 超氧自由基清除率测定
参照龚霞等[14]的方法并进行适当改进，配制0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mg/mL黄精多糖水溶液，准确移取0.20 mL 不同浓度的黄精多糖提取液于比色管中，加入4 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH值 8.2)和4 mL 20 mmol/L的邻苯三酚溶液，摇匀后，25 ℃水浴反应10 min，加入1% HCl溶液4 mL，于325 nm处测定吸光度(Ax)，以相同体积蒸馏水作为空白对照，测定空白对照组吸光度A0，VC作为阳性对照，平行测定3次，求平均值。按下式计算黄精多糖超氧自由基清除率。
1.7 数据处理
采用Design-Expert 10.0.3、Excel 2016等软件对试验数据进行分析处理。
2.1 标准曲线绘制
根据试验结果进行线性回归，得葡萄糖标准曲线：y=0.014 2x-0.006 9，R2=0.996 5，表明在10.56～52.80 μg/mL浓度范围内，葡萄糖浓度与其吸光度具有良好的线性关系。
2.2 单因素试验
液料比：由图1A可知，随着液料比的增加，多糖得率先升高再降低，当液料比为20∶1时，多糖得率最高，故选择15∶1、20∶1和25∶1进行响应面试验。
加酶量：由图1B可知，随着加酶量的增多，多糖得率逐步提高，后趋于稳定，当加酶量超过1.5%后，多糖得率变化不大。故选择1.0%、1.5%和2.0%进行响应面试验。
超声功率：由图1C可知，随着超声功率的增加，黄精多糖得率逐步提高，当超声功率大于360 W时，黄精多糖得率几乎不变。故选择320 、360和400 W进行响应面试验。
酶解pH值：由图1D可知，随着酶解pH的增加，多糖得率先增大后减小，当酶解pH值在4.0～6.0范围内，黄精多糖得率较高。故选择4.0、5.0和6.0水平进行响应面试验。
A. 液料比(mL/g)；
B. 加酶量；
C. 超声功率；
D. 酶解pH值图1 各因素对黄精多糖得率的影响
2.3 响应曲面法优化提取工艺
2.3.1 黄精多糖得率的数学模型建立
根据单因素分析结果，以液料比(A)、加酶量(B)、超声功率(C)、酶解pH值(D)为自变量，以黄精多糖得率为响应值(Y)，采用Box-Benhnken试验设计法进行4因素3水平的响应面试验结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
通过Design-Expert 10.0.3软件将模型进行分析，拟合得到影响黄精多糖得率的回归方程：
得率Y=27.67+0.46A+0.75B+0.34C+0.55D+0.13AB-0.29AC-0.095AD+0.14BC-0.26BD-0.058CD-0.85A2-3.37B2-2.36C2-4.07D2。
表3 回归模型方差分析
2.3.2 黄精多糖得率的响应面分析
响应面的陡峭程度反映了不同因素对黄精多糖得率的影响程度，响应面越陡，说明该因素对结果的影响越大[15]。图2A～图2F表示各影响因素两两作用对黄精多糖得率的交互影响，其中加酶量对黄精多糖得率影响最大，表现为响应曲面最陡，之后影响因素依次为酶解pH值、液料比、超声功率，与上述方差分析结果一致。
A. 超声功率360 W，酶解pH值5.0；
B. 加酶量1.5%，酶解pH值5.0；
C. 加酶量1.5%，超声功率360 W；
D. 液料比20∶1，酶解pH值5.0；
E. 液料比20∶1，超声功率360 W；
F. 液料比20∶1，加酶量1.5%图2 各因素交互影响多糖得率的曲面图
2.3.3 模型验证
通过建立的模型预测黄精多糖最佳提取工艺为：液料比为21.322∶1(mL/g)，加酶量1.558%，超声功率362.32 W，酶解pH值5.061，其得率为27.81%，考虑试验操作的可控性，对上述最优提取工艺进行修正：液料比为21∶1(mL/g)，加酶量1.6%，超声功率360 W，酶解pH值5.0。在此条件下进行验证试验，平行测定3次，黄精多糖平均得率为27.02%，与预测值27.81%较为接近，表明该模型能够预测黄精多糖的提取工艺，模型可靠。
2.4 黄精多糖抗氧化作用分析
2.4.1 清除DPPH自由基能力
由图3可知，VC对DPPH的清除能力远远大于黄精多糖。黄精多糖的清除能力与其浓度呈现明显的量效关系，即随着黄精多糖浓度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐渐增强，且趋于平缓，当黄精多糖浓度达到2.00 mg/mL时，黄精多糖对DPPH的清除能力达到78.56%。对试验结果进行线性拟合得出方程：Y=35.571X+11.619，R2=0.967 6，根据方程计算出黄精多糖对DPPH半清除率IC50为1.08 mg/mL。
图3 黄精多糖和VC对DPPH自由基的清除作用
2.4.2 清除超氧自由基能力
黄精多糖和VC对超氧自由基的清除作用如图4所示，在0.40～2.00 mg/mL浓度范围内，黄精多糖对超氧自由基有一定的清除能力，且随着浓度的增加而增强，清除率由34.25%增加至74.78%，而同浓度的VC对超氧自由基的保持较高的清除率，由88.25%增加至94.38%，且趋于平缓。对试验结果进行线性拟合得出方程：Y=27.089X+24.924，R2=0.951 7，根据方程计算出黄精多糖对超氧自由基半清除率IC50为0.93 mg/mL。
图4 黄精多糖和VC对的清除作用
水提醇沉法是多糖传统的提取方法，但提取效率较低，耗时较长，不适用于大规模生产。近年来，随着生物科技的迅猛发展，新的多糖提取方法也逐步完善。酶解辅助提取法具有反应条件温和，提取效率高等优点，该法常用的酶主要有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶以及相关复合酶等；
超声提取法能够缩短提取时间，加速多糖的溶出速度，但超声时间不宜过长，否则会引起多糖的降解，影响多糖得率。为了提高黄精多糖的得率，本试验利用超声辅助复合酶法提取黄精多糖，针对影响黄精多糖得率的液料比、加酶量、超声功率和酶解pH值4个因素进行单因素试验，采用响应曲面法确定最佳工艺参数为：10 g黄精粉末，液料比为21∶1(mL/g)，加酶量1.6%，超声功率360 W，酶解pH值5.0，黄精多糖得率可达27.02%，是普通水提法的3.75倍[16]，与苑璐等[10]采用纤维素酶和木瓜蛋白酶提取黄精多糖相比，多糖得率提高了6.47%，这可能是由于超声辅助提取黄精多糖，更有利于加快多糖的溶出速度，在一定程度上提高黄精多糖的得率；
与巫永华[17]采用超声微波协同单一酶法提取黄精多糖相比，多糖得率提高了9.59%，这可能是由于不同酶的作用位点不同，选择合适的复合酶，较单一的酶，更有利于多糖的溶出。目前，低共熔溶剂法被广泛应用于多糖提取，该法具有性质稳定、价格低廉、绿色环保等优点，适用于工业化生产，汪涛等[18]采用尿素-氯化胆碱低共熔溶剂提取黄精多糖，采用响应面法确定最佳工艺参数，在此条件下黄精多糖得率为18.55%，但较本试验黄精多糖得率低8.47%。
在响应曲面法优化黄精多糖工艺中，加酶量对多糖得率影响最大，这可能是由于加入的纤维素酶和果胶酶越多，酶与多糖的结合点越多，加速细胞壁溶解，有利于多糖的溶出[19]；
之后影响因素依次是酶解pH值、液料比和超声功率， pH 值过高或过低，均会降低酶的活性，细胞破壁程度降低，影响胞内多糖的渗出[20]；
液料比越大，黄精细胞内外多糖浓度差越大，传质推动力越大，黄精多糖就越容易浸出[7]，但当料液比过高时，减少了样品与酶的接触，影响了多糖得率；
超声功率越大，超声产生的“空化效应”破坏细胞壁，降低传质阻力，提高多糖的溶出速度[21]，但当功率过大时，可能会导致温度升高，影响酶的活性。然而在复合酶法提取多糖的过程中，由于不同水解酶的pH值和温度不一样，故复合酶中水解酶的选择和用量配比还需进一步研究。
黄精多糖对DPPH自由基和超氧自由基的半清除率(IC50)分别为1.08 mg/mL、0.93 mg/mL，且其对DPPH自由基和超氧自由基清除率随着浓度增加而增强，表现出良好的剂量效应关系，当黄精多糖浓度达到2.00 mg/mL时，其清除率达到78.56%和74.78%。综上所述，黄精多糖具有良好的抗氧化活性，后续试验将对黄精多糖的结构和功效进行探究，有助于加快黄精多糖制剂的开发，为研制新兽药奠定基础。
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