崔吉洁 蔡文波 庄庆辉 高爱平 黄建峰 陈亚辉 宋志忠，
（1. 鲁东大学农林工程研究院 山东省高校作物高产抗逆分子模块育种重点实验室，烟台 264025；
2. 中国热带农业科学院作物品种资源研究所，海口 571100；
3. 南京林业大学林学院，南京 210037）
铁（Fe）是植物维持正常生命活动所必需的微量矿质元素之一，在植物生长发育、花的开放、果实品质和产量方面起重要作用［1-3］，土壤缺铁抑制植物生长，降低果实产量，影响果实品质［4-6］。目前，相关研究集中在生理生化层面，果树铁素营养与代谢的分子机制尚不清楚。因此，研究果树铁素营养与代谢的分子基础具有重要的科学意义。
铁硫簇（Fe-S cluster）是铁硫蛋白的活性部位，Fe-S 簇的组装是一个高度复杂和协调的过程，需要多种功能性蛋白参与且有序进行［7-10］。Fe-S 簇装配机制是植物铁素营养和铁代谢的核心环节，在植物的生命过程中具有至关重要的作用［2,8-11］。研究表明，植物铁硫蛋白存在于质体、线粒体、细胞质和细胞核等亚细胞器官中，直接参与光合作用、呼吸作用、氮同化、氨基酸和嘌呤代谢、植物激素合成和DNA 修复等多种重要生命过程［7-9,11-14］。硝酸还原酶（nitrite reductase, NIR）在叶绿体中氮的同化过程中起重要作用，乌头酸酶（aconitase, ACO）和琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase, SDH）直接参与线粒体中糖代谢的柠檬酸循环［2,8-9］。植物中，一个典型的Fe-S 簇装配过程可分为2 个阶段：第一阶段，即S 和Fe 结合在支架蛋白上形成Fe-S 簇；
第二阶段，将Fe-S 簇转移到靶蛋白，整个装配过程涉及到铁供体（FH）、硫供体（NFS）、支架蛋白（SUFB、SUFC、SUFD、NFU、NBP35 等）及转运蛋白（SUFA、ISA、INDL、GRX、HSCA）等40 多个功能蛋白参与［8-9,12-15］。
目前，模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中Fe-S 簇装配机制及其调控的分子机理研究的最为透彻，在不同的亚细胞器官中确定了3 种Fe-S 簇装配机制，即质体硫调动（sulfur mobilization, SUF）、线粒体Fe-S 簇装配（iron-sulfur cluster, ISC）和细胞质Fe-S 簇装配（cytosolic iron-sulfur cluster assembly,CIA），其中，质体SUF 和线粒体ISC 两种机制均以独立的方式运行，而细胞质CIA 机制中Fe-S 簇的装配依赖于线粒体完成［8-9,15］。
近年来，国内外学者围绕植物Fe-S 簇装配机制开展的研究主要集中在拟南芥［8-9］、水稻（Oryza sativa）［16］和大豆（Glycine max）［17］等一年生模式植物。果树中Fe-S 簇装配机制的研究极少，仅在桃（Prunus persica）［18-19］和葡萄（Vitis vinifera）［20］中克隆了Fe-S 簇装配相关基因，杧果（Mangifera indica）Fe-S 簇装配的分子机制依然未知。参与线粒体ISC 装配机制的基因有20 余个，其中，ISU1在水稻［16］、桃［19］和葡萄［20］中表达量最高。然而，有关ISU1生物学功能的研究仅在拟南芥中有报道［9,11］，其他作物ISU1的生物学功能依然未知。
本研究以二倍体‘桂热82’杧果（Mangifera indica）为材料，克隆参与线粒体ISC 装配机制的关键基因MiISU1，明确其在杧果不同组织部位的组织特异性表达模式，及其在嫁接幼苗中对缺铁和高铁毒害的响应特征，为研究杧果Fe-S 簇装配机制及热带作物铁素营养与代谢的分子机制提供理论依据。
1.1 材料
供试材料为中国热带农业科学院作物品种资源研究所提供的五年生‘桂热82’杧果和一年生嫁接幼苗，野生型拟南芥Col-0、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株和植物表达载体pHB 为鲁东大学农林工程研究院实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 胁迫处理 利用一年生‘桂热82’嫁接幼苗，按照Liang 等［16］和Song 等［19］方法，以1/2 MS 液体培养基为对照，进行缺铁（0 mmol/L）和高铁毒害（50 mmol/L FeNa-EDTA）处理。
1.2.2 生理生化分析 利用电子天平称量植株生物鲜重；
参照Song 等［19,21-22］方法，植物材料烘干后利用HNO3-HClO4法消解，通过电感耦合等离子体原子发射光谱仪ICP-AES（IRIS Advantage, Thermo Electron, USA）测定铁含量。根据Liang 等［16］和Song 等［19］方法测定ACO 活性，利用中国南京建成生物工程研究所研发的检测试剂盒进行NiR 和SDH活性测定［16-17,19］。根据Song 等［19,22］方法进行叶绿素的提取，新鲜叶片浸泡在95%乙醇中，置于4℃黑暗过夜，收集上清液，利用BioRad SmartSpec 3000 吸光度分光光度计（Wadsworth, Illinois, USA）测量总叶绿素含量。试验设置3 次生物学重复，每次选用20 棵拟南芥幼苗。
1.2.3 杧果MiISU1的克隆 以拟南芥ISU1 氨基酸序列为参考序列，在杧果基因组数据库［23］中检索可能的杧果MiISU1 同源蛋白。运用Pfam（http：//pfam.xfam.org/search）在线服务器预测功能结构域。在杧果基因组数据库获得杧果MiISU1的CDS 序列（coding sequence），设计上下游引物，提取‘桂热82’嫁接苗叶片的RNA，通过PrimeScriptTMRT reagent Kit 反转录试剂盒（TaKaRa，大连）合成第一链cDNA 作为模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大连）扩增目的基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。
1.2.4 系统发育树建立 利用ClustalX 2.0.13 软件对杧果、桃、苹果（Malus domestica）、草莓（Fragaria vesca）、葡萄、柑橘（Citrus sinensis）、拟南芥、盐芥（Thellungiella salsuginea）、短柄草（Brachypodium distachyon）、白杨（Populus trichocarpa）、番茄（Solanum lycopersicum）、大豆和水稻13 种植物同源家族蛋白分别进行氨基酸序列比对，利用MEGA 7.0 中的邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统进化树，分析遗传进化关系。
1.2.5 实时荧光定量PCR 分析 利用NCBI/Primer-BLAST 在线服务器，设计杧果MiISU1特异性表达引物（上 游 引物：5′-AACATCTTTCTCTGCCTCCG-3′，下游引物：5′-GCATCAGCAGCCTTCTCAAT-3′），以杧果Actin为内参［24-25］，通过ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪检测杧果MiISU1的组织特异性表达特征及其对胁迫处理的响应差异。荧光染料使用SYBR Green（TaKaRa，大连），反应体系参照商品说明书的描述，反应程序为95℃ 30 s；
95℃ 5 s，58℃ 34 s，40 个循环；
72℃ 10 s。每个反应进行3 次生物学重复，在ABI 7500 PCR 仪获得相应的Ct 值，经内参基因Actin均一化处理，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量［16,19,24-25］。
1.2.6 超表达拟南芥转基因株系的创制 设计构建重组表达载体引物（上游引物序列：5′-GACGGATC CATGCTGAGACTCGCTTCAAAG-3′，下划线为BamHI限制性酶切位点；
下游引物序列：5′-GAGTCTAGA TCAAGCATCAGCAGCCTTCTC-3′，下划线为XbaI 限制性酶切位点），扩增ISU1的CDS 片段，利用T4 DNA Ligase（TaKaRa，大连）连接ISU1和植物表达载体pHB（实验室保存）［24-25］，获得重组质粒pHBMiISU1，并进行双酶切验证。利用农杆菌介导的花序侵染法，将重组质粒pHB-MiISU1转化野生型拟南芥Col-0，分别在含有5 和10 mg/L 潮霉素的1/2 MS培养基平板上筛选T1代阳性抗性苗，通过PCR 验证阳性植株，随机收获编号#6 的转基因拟南芥进行后续生理表型分析。收获#6 转基因拟南芥的T3代种子，在1/2 MS 固体培养基上播种，萌发3 d 后，取20 棵幼苗转移到缺铁的1/2 MS 固体培养基中处理5 d 时观察植株生长情况，共进行3 次生物学重复。
1.2.7 数据分析 利用SPSS 13.0（SPSS Chicago，美国）对数据进行显著性分析，杧果幼苗在胁迫处理与对照条件2 个独立样品间进行t检验（*P<0.05，**P<0.01）。
2.1 杧果ISU1的鉴定与克隆
参考拟南芥ISU1 氨基酸序列，在杧果基因组数据库中检索到1 个杧果同源蛋白MiISU1，Pfam 预测其含有NifU-like N terminal domain 功能结构域，编码属于线粒体ISC 装配机制的支架蛋白Scaffold。以‘桂热82’叶片RNA 反转录获得的cDNA 为模板，克隆获得一条525 bp 的片段，命名为杧果MiISU1。
2.2 植物ISU同源蛋白系统发育树
氨基酸序列比对结果（图1）表明，杧果、桃、苹果、草莓、葡萄、柑橘、拟南芥、盐芥、短柄草、白杨、番茄、大豆和水稻13 种植物ISU1 同源蛋白的序列一致性高达79.12%，并在多处结构域区段高度一致，暗示该蛋白在不同物种进化过程中的功能较为保守。
图1 13 种植物ISU1 同源蛋白氨基酸序列一致性分析Fig. 1 Amino acid sequence identity analysis of ISU1 homologs from 13 plant species
系统发育树构建结果（图2）表明，13 种不同科属植物ISU 同源蛋白之间的遗传进化距离差异较大，漆树科杧果MiISU1 和芸香科柑橘ISU1 紧密聚在一起，两者之间的遗传距离最近，禾本科水稻和短柄草ISU 同源蛋白不同成员之间倾向于聚在一起，十字花科拟南芥和盐芥ISU 同源蛋白不同成员之间紧密地聚在一起，蔷薇科草莓、桃和苹果ISU 同源蛋白倾向于紧密聚在一起。
图2 13 种植物ISU 同源蛋白系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of ISU homologs from 13 plant species
2.3 杧果MiISU1的表达模式分析
实时荧光定量PCR 分析结果（图3）表明，杧果MiISU1在五年生‘桂热82’新生叶片、新生韧皮部、新生根、花蕾期花朵、盛开期花朵、幼果和成熟果实中均有表达，且表达水平差异较大，ISU1在杧果幼果中的表达量最高，其次是成熟果实、盛开期花朵、花蕾期花朵和新生叶片，在新生根和新生韧皮部中的表达量较低。
图3 杧果MiISU1 的组织特异性表达分析Fig. 3 Tissue-specific expression analysis of MiISU1 gene in mango
2.4 杧果MiISU1对不同铁素供应的差异响应
以嫁接一年的‘桂热82’幼苗为材料，通过实时荧光定量PCR 分析杧果MiISU1对不同铁素水平供应的响应特征，结果（图4）表明，与对照相比，缺铁处理显著抑制了MiISU1在一年生杧果嫁接幼苗根中的表达量，茎和叶片中的表达量没有显著变化，而高铁毒害显著增强了MiISU1在整株幼苗不同组织中的表达量。
图4 杧果MiISU1 对不同铁素供应条件的响应差异Fig. 4 Differential responses of MiISU1 gene to different Fe supplies in mango tissue culture seedlings
2.5 杧果MiISU1的功能初析
构建重组表达载体pHB-MiISU1（图5-A），创制异源超表达杧果MiISU1的转基因拟南芥株系，筛选获得8 个T1代阳性株系，PCR 验证均获得一条525 bp 的MiISU1目的基因条带（图5-B）。随机选取#6 号阳性株系，以其T3代种子进行生长表型和不同铁素胁迫处理。
图5 超表达MiISU1 转基因拟南芥创制及验证Fig. 5 Generation and verification of MiISU1 over-expression transgenic Arabidopsis seedlings
与对照相比，缺铁处理显著抑制了拟南芥植株的生长，并降低了植株铁素富集能力和NiR、ACO和SDH 等铁硫蛋白的酶活力（图6 和表1）。在对照条件下，植株生长5 d 时，T3代转基因株系的生长情况显著好于野生型，地上部、地下部的生物鲜重显著高于野生型，T3转基因株系叶片NiR、ACO和SDH 酶活均显著高于野生型，叶绿素含量没有显著差异（图6-A 和表1）。在缺铁胁迫条件下，植株生长5 d 时，T3代转基因株系和野生型的叶片均发生失绿，而T3代转基因拟南芥根部的生长情况显著好于野生型，T3代转基因拟南芥根部生物鲜重、叶片叶绿素含量、ACO 和SDH 酶活力均显著高于野生型，而地上部生物鲜重和NiR 酶活力没有显著差异（图6-B 和表1）。在高铁毒害条件下，植株生长5 d时，野生型和转基因株系的生长均枯萎死亡。此外，在对照和缺铁处理条件下，T3代转基因拟南芥整株的铁含量均显著高于野生型（表1）。以上结果表明，MiISU1在拟南芥中超表达有效增强了转基因株系的生长情况，并通过增强转基因植株的根系发育近而提升了对缺铁胁迫的耐受能力。
表1 转基因拟南芥缺铁处理5 d 的生理分析Table 1 Physiological analysis of transgenic Arabidopsis seedlings under Fe depletion for 5 d
图6 超表达MiISU1 转基因拟南芥表型分析Fig. 6 Phenotype analysis of MiISU1 over-expression transgenic Arabidopsis seedlings
铁是果树生长发育最为重要的微量元素之一，与果树生长、果实品质和产量密切相关［2-6,11］。本研究发现，缺铁处理显著抑制了拟南芥植株的生长、叶绿素合成、铁素富集能力和NiR、ACO 和SDH 等铁硫蛋白的酶活力，这些结果与水稻［16］、大豆［17］和桃［19］中的报道是一致的，再次验证铁是果树生长发育过程中必不可少的微量元素。
生物界中Fe-S 簇装配机制是高度复杂的，不管是原始生物还是真核生物，其Fe-S 簇装配机制一直是非常保守和稳定的［9,11,26］。本研究从漆树科植物杧果中鉴定了1 个参与线粒体ISC 装配机制的MiISU1基因，其编码产物与已报道植物ISU 同源蛋白的氨基酸序列一致性非常高（79.12%），在多个区域片段的氨基酸序列完全一致，暗示杧果Fe-S 簇装配机制与模式植物一样，也是高度保守的。特别地，本研究仅在杧果基因组中鉴定到1 个ISU 家族蛋白，这一现象与苹果、桃、草莓和葡萄一致［18-20］，而水稻、短柄草和番茄中含有2 个ISU 同源蛋白（ISU1和ISU2）［16］，拟南芥、盐芥中含有3 个ISU 家族蛋白（ISU1-3）［8-9,11］。此外，Léon 等［26］发现拟南芥AtISU3的表达水平很低，该基因可能没有功能或是假基因。因此，推测植物线粒体ISC 装配机制中的非功能性ISU 支架蛋白在长期进化过程中更容易发生丢失，多年生果树作物铁代谢过程中可能利用更少数量的功能性ISU 支架蛋白。
本研究所选择的13 种不同科属植物中，杧果MiISU1 和柑橘ISU1 之间的遗传距离最近，同属于蔷薇科的桃、草莓和苹果ISU1 同源蛋白紧密聚集在一起，3 种禾本科植物短柄草、水稻和大豆的ISU同源蛋白倾向于聚在一起，而十字花科植物拟南芥和盐芥含有最多的ISU 蛋白成员，其同源蛋白分别两两紧密聚在一起，这些结果表明，同一科属或近属植物的ISU 同源蛋白在系统发育树上的遗传距离更近，在长期进化过程中更倾向于拥有相同或相近的生物学功能。因此，研究杧果ISU1 蛋白功能可能为揭示漆树科作物ISU1 生物学功能提供理论依据。
杧果MiISU1在幼果果实中的表达水平最高，这一发现与桃［18-19］和葡萄［20］中ISU1的表达情况基本一致，与水稻［16］和大豆［17］略有不同，这两种植物ISU1均在地上部显著表达。值得注意的是，杧果、桃和葡萄均属于典型的果树作物，暗示在果实形成初期可能需要更多的功能性ISU1 支架蛋白参与线粒体ISC 装配机制。此外，杧果MiISU1在幼苗不同部位对铁素供应情况的响应存在差异，缺铁胁迫显著降低了幼苗根中MiISU1的表达水平，而高铁毒害显著增强了整株幼苗中MiISU1的表达水平，推测MiISU1 可能在杧果根中铁素代谢与营养方面也发挥重要作用，且受铁素供应水平的调控。
拟南芥AtISU1 作为支架蛋白与分子伴侣HSCB相互作用，参与线粒体ISC 装配机制［11,26-27］。本研究发现，超表达MiISU1有效改善了转基因拟南芥的铁素富集能力、叶绿素合成和关键铁硫蛋白的酶活力，并通过增强转基因植物根系发育而提升了缺铁胁迫的耐受能力。因此，推测MiISU1在拟南芥中超表达后可能会积极调动前期在1/2 MS 完全培养基中萌发时所积累的有限的铁，特别是在缺铁胁迫条件下，积极调动转基因株系根部尽可能地从铁素匮乏环境中富集更多的铁，用于维持植株基本的光合作用和必须依赖铁的关键铁硫蛋白的活性，诸如线粒体内直接参与三羧酸循环的SDH 和间接参与柠檬酸异构化作用的ACO，均与糖类、脂类和氨基酸密切相关的代谢通路，进而有效抵抗缺铁不利环境对植物的迫害作用。与此同时，本研究证实不管是对照条件或缺铁胁迫下，转基因株系的铁含量、ACO和SDH 酶活力均显著高于野生型。因此，揭示杧果MiISU1 的功能为研究漆树科植物ISU1 同源蛋白的生物学功能奠定了理论依据。
从杧果中分离并鉴定了MiISU1，其在幼果中的表达量最高；
超表达MiISU1显著提高了转基因拟南芥的生长情况、铁素富集水平、叶片叶绿素含量、硝酸还原酶、乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶的酶活力，并通过增强转基因植株的根系发育近而提升了对缺铁胁迫的耐受能力。