张 静，冯 潮，王胜威，杨瑞丽，李 武,3,*
（1.海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228；
2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；
3.五邑大学生物科技与大健康学院，广东 江门 529020）
多糖是由10 个以上的单糖通过糖苷键连接而成的大分子碳水化合物。作为构成生命体的基本分子之一，多糖广泛地参与细胞的增殖、分化和信号传导等生理活动[1]。研究表明，多种天然多糖具有抗凝血[2]、免疫调节[3]、抗肿瘤[4]、调节肠道菌群[5]等多种生物活性。
目前对于天然来源的多糖，通常采用水提醇沉的方法获得粗多糖，采用Sevag法[6]、三氯乙酸[7]或大孔树脂吸附[8]等方法去除粗多糖的蛋白和色素等杂质，并进一步采用离子层析和分子筛纯化获得组分较为均一的多糖[9-10]。一些天然来源的多糖，可以通过分级醇沉的方法分离获得纯度较高的多糖。Wang Lei等[11]采用30%、50%和80%分级醇沉的方法，从刺梨中分离到不同分子质量的多糖组分；
Feng Lei等[12]采用分级醇沉的方法从决明子中分离到分子质量为9.56×105Da和0.94×105Da的两个均一多糖组分。
研究显示，多糖的生物活性与其糖基的组成、连接方式等结构密切相关。Yang Xiaolong等[13]从生姜中分离出一种以(1,4)-α-D-葡萄糖（glucose，Glc）为主链的低分子质量多糖，其具有促进巨噬细胞增殖，诱导NO、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6分泌的作用。Zhou Shiyang等[14]从山药中分离出一种由(1,4)-α-D-Glcp组成的摩尔质量为7.28×104g/mol的多糖，其具有清除羟自由基的活性。同时研究显示，相同来源的植物中可能存在多种结构的活性多糖。Yang Yu等[15]分离到一种以→6)-β-半乳糖（galactose，Gal）(1→为主链的枸杞多糖，其C3具有α-阿拉伯糖（arabinose，Ara）、β-Galp和α-鼠李糖（rhamnose，Rha）分支，这种枸杞多糖具有调节肠道菌群、降低高脂诱导的小鼠脂肪堆积的作用。Wu Jiaxin等[16]分离出一种以1,3-β-Galp为主链的枸杞多糖，其C6具有(1,5)-α-Araf、(1,6)-β-Galp、(1,3)-α-Araf、(1,4)-α-Araf分支，这种多糖显示出神经保护的作用。从前期多糖的报道可以发现，不同或相同来源的植物多糖，其结构和活性呈现多样性的特点。但是，由于天然来源多糖的分子质量较大、组成复杂，结构分析较困难。目前，天然多糖的结构解析仍然是限制多糖研究应用的瓶颈。
龙眼是我国南方特色水果，干制龙眼（桂圆）为《中华人民共和国药典》收录的一味中药，具有养血安神、补益心脾、益智健脑等功效[17-18]。药理学研究表明，龙眼多糖具有免疫调节[19]、抗肿瘤[20]等生物活性。研究人员前期已从龙眼果肉中分离到几种活性多糖。Gan Tingsheng等[9]从新鲜龙眼中分离出1 种由(1→6)-α-D-Glcp组成的多糖；
并从干制龙眼中分离出1 种由(1→6)-α-D-Glcp、(1→3)-β-D-Glcp、(1→3)-β-DGalp及(1→3)-α-L-Rhap组成的多糖，上述两种多糖均具有促进脾淋巴细胞增殖和巨噬细胞NO、IL-1β和IL-6分泌的作用。Bai Yajuan等[21]报道了1 种以(1→3,4)-α-Rhap、(1→4)-β-Galp、(1→6)-β-Galp和(1→3,6)-β-Galp为主链的龙眼多糖，其具有抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的提升巨噬细胞TNF-α、IL-6、NO和前列腺素E2分泌的作用。Rong Yu等[19]纯化获得了1 种以(1→4)-β-Glc和(1→6)-β-甘露糖（mannose，Man）为主链的具有免疫调节活性的龙眼多糖。综合前期龙眼多糖的文献可知，龙眼中存在多种结构的活性多糖。对不同龙眼多糖的结构与活性的研究可以为明确龙眼的主要活性物质基础与龙眼的精深加工提供依据。本实验通过分级醇沉的方法从龙眼果肉中纯化获得1 种活性多糖组分（记为LP），并对其结构进行表征，同时分析其激活巨噬细胞的作用，旨在为龙眼的高值化开发利用提供参考。
1.1 材料与试剂
‘储良’龙眼2020年7月采摘自广东省高州市龙眼种植基地，去皮去核，热风干燥至水分质量分数为12%，-20 ℃冻存备用。
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院细胞库。
D301R大孔交换树脂 天津兴南允能高分子技术有限公司；
重蒸酚 北京索莱宝公司；
3,5-二硝基水杨酸美国默克公司；
无水乙醇、硫酸、盐酸、氢氧化钠、牛血清白蛋白 中国医药集团有限公司；
二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒上海碧云天生物技术公司；
小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β酶联免疫吸附试验试剂盒 美国R&D公司。
1.2 仪器与设备
细胞计数器 美国BIO-RAD有限公司；
CR22N高速冷冻离心机 日本日立公司；
LGJ-10真空冷冻干燥机北京松源华兴科技公司；
Frontier傅里叶变换红外光谱仪美国珀金埃尔默有限公司；
1260高效液相色谱 美国安捷伦科技公司；
BI-MwA多角度激光光散射仪 美国布鲁克海文仪器公司；
AV-600 MHz核磁共振仪 瑞士Bruker公司；
紫外-可见分光光度计 美国PE公司；
311型二氧化碳培养箱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
CytoFLEX LX型流式细胞仪 美国Beckman Coulter公司。
1.3 方法
1.3.1 龙眼多糖LP的提取
依照文献[22]提取龙眼多糖LP：100 g龙眼干加入体积分数85%乙醇溶液浸泡48 h后，通风阴干。浸泡后的龙眼果肉打浆，按照料液比为1∶20（g/mL）加入蒸馏水，80 ℃水浴搅拌提取2 h。提取液经9 000 r/min离心15 min，收集上清液。取沉淀采用上述方法复提2 次，合并3 次提取液，55 ℃减压蒸发浓缩至原体积的1/10。按料液比0.61∶1（m/V）向浓缩后的多糖溶液中加入D301R大孔树脂，48 ℃吸附2 h，除去色素和蛋白。使用纱布过滤除去大孔树脂及残渣。待提取液冷却至室温，加入无水乙醇至乙醇终体积分数为20%，然后4 ℃沉淀10 h，10 000 r/min离心15 min，收集上清液。在上清液中加入无水乙醇至乙醇终体积分数为33.3%，4 ℃沉淀10 h，10 000 r/min离心15 min，收集沉淀。随后加入适量蒸馏水重悬沉淀，55 ℃减压蒸发除去乙醇。浓缩液经透析、冻干后得到龙眼多糖样品LP，称质量并按下式计算龙眼多糖LP得率。
1.3.2 龙眼多糖LP中总糖、糖醛酸、蛋白质量分数测定
采用苯酚-硫酸法[23]测定样品中的总糖质量分数。取1 mL 0.1 mg/mL龙眼多糖LP溶液于玻璃试管中加入质量分数6%苯酚水溶液1 mL，混匀后加入5 mL质量分数98%浓硫酸，静置30 min，测定490 nm波长处吸光度，根据SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸法》计算总糖质量分数。
采用咔唑-硫酸法[24]测定样品中的糖醛酸质量分数。取1 mL10 mg/mL龙眼多糖LP溶液于玻璃试管中加入0.25 mL咔唑-乙醇溶液，充分混匀后加入5 mL浓硫酸，85 ℃水浴10 min，测定525 nm波长处吸光度。
采用BCA蛋白浓度试剂盒测定样品中的蛋白质量分数。
1.3.3 龙眼多糖LP的紫外-可见光谱分析
取1 mg/mL龙眼多糖LP溶液，使用紫外-可见光分光度计分析，扫描范围190～800 nm，记录光谱图。
1.3.4 龙眼多糖LP分子质量的测定
取3 mg多糖样品溶于1 mL、0.1 mol/L的硝酸钠溶液中，55 ℃水浴超声20 min，过0.45 μm微孔滤膜备用。凝胶渗透色谱激光光散射（gel permeation chromatography with laser light scattering，GPC-LLS）条件：流动相为0.1 mol/L的硝酸钠溶液，色谱柱为Ultrahydrogel 1000柱（7.8 mm×300 mm，12 µm）串联Ultrahydrogel 2000柱（7.8 mm×300 mm，12 µm），激光光散射及示差检测器，柱温50 ℃，流速0.6 mL/min，进样量为100 μL。采用BIC ParSEC软件分析数据并计算数均分子质量（mn）、重均分子质量（mw）、峰值分子质量（mp）、Z均分子质量（mz）以及分散系数（mw/mn）。
1.3.5 龙眼多糖LP中单糖组成分析
取10 mg龙眼多糖LP样品于钳口瓶中，加入5 mL 2 mol/L三氟乙酸，氮气封瓶，100 ℃水解2 h；
冷却至室温，取1 mL混合液加入1 mL无水甲醇，采用氮气吹干后再加入1 mL甲醇复溶，氮气吹干，重复两次，以除去三氟乙酸。干燥样品加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解制得龙眼多糖LP水解液。
衍生化处理：取400 μL龙眼多糖LP水解液加入等体积1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，涡旋混匀，70 ℃水浴2 h，冷却至室温。样品加入400 μL 0.3 mol/L HCl溶液然后加入1 200 μL蒸馏水，再加入等体积的氯仿充分混匀后静置，弃去氯仿，重复上述操作萃取2 次。萃取后样品进行高效液相色谱分析：色谱柱C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；
流动相A为90 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）；
流动相B为色谱纯乙腈；
柱温30 ℃；
流速1 mL/min；
进样量10 μL；
检测器为二极管阵列检测器。
1.3.6 龙眼多糖LP的傅里叶变换红外光谱分析
将龙眼多糖LP样品粉末及KBr在60 ℃烘干至恒质量。采用KBr压片法将样品制成透明均匀压片，扫描范围400～4 000 cm-1，记录红外光谱图。
1.3.7 龙眼多糖LP的核磁共振波谱分析
将70 mg龙眼多糖LP样品溶解于700 μL重水中，采用AV-600MHz核磁共振仪测定记录1H、13C波谱以及异核单量子相干谱（heteronuclear single quantum coherence，HSQC）、1H异核多碳相关谱（1H detected heteronuclear multiple bond correlation，HMBC）和同核氢-氢相关谱（homonuclear1H-1H correlation spectroscopy，1H-1H COSY）。
1.3.8 巨噬细胞吞噬能力测定
将对数生长期的巨噬细胞以2×105个/mL接种至24 孔板中，每孔1 mL。37 ℃、5% CO2培养24 h；
吸弃上清液，分别加1 mL含不同终质量浓度（50、100、200 μg/mL）LP的完全培养基（含体积分数10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）），LPS组和空白对照组分别加入1 mL含5 μg/mL LPS的完全培养基和完全培养基，每组3 个复孔，刺激培养24 h；
吸弃上清液，各孔分别加入1 mL含异硫氰酸荧光素酯（fluorescein 5-isothiocyanate，FITC）荧光微球的完全培养基（荧光微球与完全培养基按照1∶10 000的体积混合均匀，37 ℃培养箱孵育30 min，超声5 min），37 ℃、5% CO2避光培养6 h，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2）清洗2 次，去除未被吞噬的荧光微球；
加入500 μL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪分析，以具有荧光信号的细胞数占总细胞数的比例表征巨噬细胞吞噬率。
1.3.9 TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量的测定
巨噬细胞以2×105个/mL接种至24 孔板中，每孔1 mL，37 ℃、5% CO2培养24 h，吸去培养基，样品组加入1 mL含不同终质量浓度（50、100、200 μg/mL）LP的完全培养基，LPS组和空白对照组分别加入1 mL含5 μg/mL LPS的完全培养基和完全培养基，37 ℃孵育48 h，每组设置3 个复孔，随后1 000 r/min离心5 min，收集上清液并在-20 ℃下保存。根据相应酶联免疫吸附试验试剂盒说明书分别测定细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的质量浓度。
1.4 数据处理与分析
每组数据重测定复3 次，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行显著性分析，P＜0.05表明具有显著性差异，采用Origin 2019软件作图。
2.1 龙眼多糖LP的组成及其紫外-可见光谱
采用分级醇沉的方法对龙眼粗多糖进行分离纯化，最终获得0.8 g多糖组分LP，得率为0.8%。如表1所示，LP中总糖、糖醛酸、蛋白质量分数分别为（96.85±0.61）%、（0.14±0.01）%、（0.53±0.23）%。如图1所示，LP在260 nm和280 nm处无明显的吸收峰，表明其蛋白和核酸含量较低。以往研究中龙眼多糖多采用离子层析和分子筛的方法分离纯化[10-12]，本研究采用分级醇沉的方法获得纯度较高的龙眼多糖LP，且本研究中龙眼多糖提取方法简便、快速，易于进一步工业化应用。
表1 龙眼多糖LP的组成Table 1 Chemical compositions of LP
图1 龙眼多糖 LP的紫外-可见光谱Fig.1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of LP
2.2 龙眼多糖LP的分子质量
如图2所示，龙眼多糖LP的激光光散射及示差检测器信号均呈现为单一的对称峰（示差检测器在洗脱体积22.5 mL附近的信号峰为流动相），表明LP均一性较好。如表2所示，LP的mn、mw、mp、mz分别为8.25×105、8.42×105、7.67×105、8.63×105Da，分散系数为1.21，分散系数约接近1，表明LP的均一性较高。多糖的生物活性与其分子质量有着紧密的联系。对于相同来源的多糖，高分子质量多糖通常比其低分子质量多糖显示出较强的免疫调节活性[19,25]。与前期报道的龙眼多糖分子质量（104～107Da）相比[26]，本研究中LP分子质量中等。龙眼多糖分子质量的差异可能与分离纯化方法不同有关。
图2 龙眼多糖LP的GPC-LLS结果Fig.2 GPC-LLS chromatogram of LP
表2 龙眼多糖LP的分子质量参数Table 2 Molecular mass parameters of LP
2.3 龙眼多糖LP的单糖组成
如图3所示，龙眼多糖LP主要由甘露糖醛酸（7.97 min（保留时间，后同））、Man（8.79 min）、Rha（10.54 min）、Glc（17.12 min）、Gal（19.08 min）和Ara（19.82 min）组成，相应物质的量分数比为0.09%∶0.35%∶0.12%∶98.70%∶0.57%∶0.20%组成。其中Glc为构成LP的主要单糖组分。
图3 龙眼多糖LP的单糖组成高效液相色谱图Fig.3 Chromatogram of the monosaccharide composition of LP
2.4 龙眼多糖LP的傅里叶变换红外光谱分析结果
如图4所示，龙眼多糖LP的红外光谱图中3 412 cm-1处特征吸收为O-H的伸缩振动引起；
2 924 cm-1处特征吸收为C-H的伸缩振动引起[27]。1 635 cm-1处附近有较强的吸收峰，表明龙眼多糖LP可能含有糖醛酸[28]；
1 423 cm-1处特征吸收是C-H的变形振动引起；
1 156、1 105 cm-1和1 014 cm-1处出现的连续峰为吡喃环中C-O-C的吸收振动引起，表明龙眼多糖LP中可能存在α型吡喃环[29]；
916 cm-1附近的吸收峰表明LP可能含有α-D-葡聚糖[30]；
762 cm-1处的吸收峰可能与吡喃糖对称环的伸缩振动有关[31]。
图4 龙眼多糖LP的傅里叶变换红外光谱Fig.4 Fourier transform infrared spectrum of LP
2.5 龙眼多糖LP的核磁共振波谱分析结果
龙眼多糖LP的核磁共振波谱分析结果如图5所示。在异头质子区域（δ4.4～5.5）中存在2 个信号峰，分别为δ5.27和δ4.92（图5A）。由图5B可知，存在δ99.28和δ97.68两个异头碳信号峰，结合二维1H-13C HSQC光谱的交叉峰位置（图5D），将异头氢信号/异头碳信号（H1/C1）的交叉峰归属为δ4.92/97.68和δ5.27/99.28，分别标记为残基A和B。
图5 龙眼多糖LP的一维和二维核磁共振波谱图Fig.5 One- and two-dimensional NMR spectra of LP
残基A、B中H、C的化学位移归属如表3所示。残基A的异头质子为δ4.92，表明其为α-构型的糖苷键[32]；
残基A上的其他质子信号（H2～H6）依据1H-1H COSY谱图（图5C）显示的交叉峰进行归类，分别对应为δ3.52（H2）、3.66（H3）、3.46（H4）、3.86（H5）、3.93（H6）；
依据二维谱1H-13C HSQC显示的交叉峰，确定C2～C6的碳谱信号峰，分别归属为H2/C2（δ3.52/71.73）、H3/C3（δ3.66/73.38）、H4/C4（δ3.46/69.50）、H5/C5（δ3.86/70.15）及H6/C6（δ3.93/65.51）。未被取代的C6化学位移一般在60左右[33]。单糖残基A中C6的出峰位移为65.51，与未被取代的C6化学位移相比，C6处的化学位移向低磁场发生了位移，表明单糖残基A的C6处有被取代[34-35]。结合LP的单糖组成与相关文献[36]，推断残基A为6)-α-D-Glcp-(1。类似的，依据残基B的H和C的化学位移及相关文献[37]，推断残基B为4)-α-D-Glcp-(1。
表3 龙眼多糖LP的1H和13C核磁共振波谱图中的化学位移Table 3 Chemical shifts in 1H and 13C NMR spectra of LP
如图5D所示，LP残基A中C1与其H6信号峰相互耦合，表明残基A中C1连接在其C6位，残基A中C1（δ97.68）和H6（δ3.93）具有相关的信号峰（AC1/AH4），表明残基A（→6)-α-D-Glcp-(1→）是以α-1,6-糖苷键自相连接。残基A中C1与残基B中H4信号峰相互耦合，表明残基A的C1连接在残基B的O4位。结合对残基A、B中H、C化学位移归属，推测龙眼多糖LP的主糖链由残基6)-α-D-Glcp-(1和4)-α-D-Glcp-(1链接组成，其结构如图6所示。
本研究中由6)-α-D-Glcp-(1和4)-α-D-Glcp-(1为主链的龙眼多糖LP与前期报道的龙眼多糖结构存在差异[21]。多糖提取、纯化方法或加工（如干燥等）方式的不同可能会引起龙眼多糖结构及其生物活性的变化[9,38]。研究表明，以6)-α-D-Glcp-(1为主链的天然活性多糖在微生物中分布较为广泛[39-40]。同时研究者从一些果蔬和中草药中也分离到一些以(1→6)-α-D-Glcp为主链的活性多糖，如Zhao Guohua等[41]从番薯中分离到1 种分子质量为53.2 kDa的(1,6)-α-D-葡聚糖，其具有促进淋巴细胞和自然杀伤细胞增殖，促进小鼠分泌免疫球蛋白G的作用。Sun Lin等[42]从人参中分离到1 种分子质量为17 kDa的(1,6)-α-D-葡聚糖，具有促进淋巴细胞增殖的作用。前期报道表明，具有6)-α-D-Glcp-(1结构的龙眼多糖表现出促进脾淋巴细胞增殖和巨噬细胞NO、IL-1β与IL-6分泌的作用[9]。关于6)-α-D-Glcp-(1结构与龙眼多糖免疫调节活性的联系，还有待进一步研究。
2.6 龙眼多糖LP对巨噬细胞吞噬能力的影响
龙眼多糖LP对巨噬细胞吞噬能力的影响如图7、8所示，质量浓度为50、100、200 μg/mL的LP具有促进巨噬细胞吞噬的作用，并呈现一定的剂量效应关系，其吞噬率分别为（15.01±0.43）%、（16.56±1.06）%和（20.88±0.71）%，分别是空白对照组的1.41、1.56、1.96 倍。
图7 龙眼多糖LP对RAW264.7细胞吞噬能力的影响Fig.7 Effect of LP on the phagocytic capacity of RAW264.7 cells
图8 龙眼多糖LP对RAW264.7细胞吞噬率的影响Fig.8 Effect of LP on the phagocytosis rate of RAW264.7 cells
2.7 龙眼多糖LP对巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影响
如图9所示，质量浓度50、100、200 μg/mL的LP诱导巨噬细胞TNF-α分泌量分别为（5 567.46±24.46）、（6 269.84±47.95）pg/mL和（5 908.73±34.13）pg/mL，分别为空白对照组的2.24、2.52、2.38 倍；
诱导巨噬细胞IL-1β分泌量分别为（19.28±0.85）、（33.31±2.19）pg/mL和（50.81±3.22）pg/mL，分别为空白对照组的3.99、6.89、10.51倍；
诱导巨噬细胞IL-6分泌量分别为（884.88±43.12）、（2 049.10±108.02）pg/mL和（2 510.08±31.26）pg/mL，分别为空白对照组的3.76、8.71、10.67 倍。以上结果表明，质量浓度50、100、200 μg/mL的LP具有促进巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。
图9 龙眼多糖LP对RAW264.7细胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C）分泌的影响Fig.9 Effect of LP on TNF-α (A), IL-1β (B) and IL-6 (C) secretion in RAW264.7 cells
巨噬细胞是非特异性免疫和特异性免疫应答的重要参与者，在多糖的免疫调节活性中起着重要的作用[43-44]。研究发现，一些天然来源的植物多糖通过细胞表面受体介导，激活核因子（nuclear factor，NF）-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号通路，诱导巨噬细胞吞噬及其NO、TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子分泌[45]。如荆芥多糖通过MAPK通路介导激活巨噬细胞，诱导其IL-6、IL-10和TNF-α的分泌[46]。白术多糖通过NF-κB信号通路激活巨噬细胞，促进其TNF-α和IL-6分泌[47]。前期研究报道的几种龙眼多糖也显示出具有诱导巨噬细胞吞噬[10,19]，促进其IL-6[9]、TNF-α[21]和IL-1β[8]分泌的作用。本研究表明，龙眼多糖LP具有显著促进巨噬细胞吞噬，诱导其TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。不同结构龙眼多糖激活巨噬细胞的作用与机制存在差异[8,19]，关于龙眼多糖LP激活巨噬细胞的作用机制还有待进一步研究。
本实验采用分级醇沉的方法纯化获得均一性较好的龙眼多糖组分LP。LP由Glc、Gal、Man、甘露糖醛酸、Ara和Rha以相对物质的量分数比为98.70%∶0.57%∶0.35%∶0.09%∶0.20%∶0.12%组成的重均分子质量为8.42×105Da的杂多糖，其主链结构为6)-α-Glcp-(1→6)-α-Glcp-(14)-α-Glcp-(-1。LP具有促进巨噬细胞的吞噬，诱导其TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。不同结构龙眼多糖及其生物活性分析，可以为龙眼的开发利用提供理论基础。
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