孙紫薇，宋超，崔丽丽，毕融冰，王玉方，刘继永，赵卉
（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）
黄精为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum Mill）植物滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）、黄精（Polygonatum sibiricum Red.）和多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根茎[1,2]。根据其形态特征，可将其分为大黄精、鸡头黄精和姜形黄精。黄精常见于中医药典籍中，药用价值较高，具有润肺、益肾和补气养阴等功效，被用于治疗胃阴不足、劳嗽咳血、脾胃气虚及体倦乏力等病症[3,4]。近些年来，由于人们对黄精关注度不断提高，研究不断深入，已经从黄精中分离出生物碱、木质素、甾体皂苷、多糖、维生素和氨基酸等多种有效成分，其中氨基酸被认为是黄精补益和增加免疫功能的物质基础[5]。刘延东等[6]、吴毅等[7]及王曙东等[8]对不同生长期、不同炮制品及不同部位黄精中的氨基酸含量进行了分析研究，但多采用前处理耗时长、操作工序复杂的高温加热水解法。1975年，Abu-samra等[9]首次采用微波技术，通过快速转换电磁场中的微波频率来改变样品中极性分子的取向，增加分子间碰撞能量，将密闭容器变成高温高压环境，从而提高蛋白质水解效率。近年来，微波消解法凭借其耗时短、成本低和高效率等特点被广泛地用于水解各种样品蛋白质[10]。
本文通过优化微波水解时间和温度等关键条件，进而考察高温加热水解法与微波消解法在水解黄精样品中产生的差异性，结合全自动氨基酸分析仪建立一种快速且高效的黄精中氨基酸的检测方法。
L-8900全自动氨基酸分析仪（日本Hitachi公司）；
SW-4微波消解仪（德国Berghof公司）；
Milli-Q Advantage A10超纯水器（美国Millipore公司）；
DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；
DZF-6090真空烘箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；
MS204S电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；
高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器设备有限公司）；
JP-100ST超声清洗机（广州市洁盟超声波清洗设备有限公司）；
MX-S可调式混合仪（大龙兴创实验仪器有限公司）。
黄精由中国农业科学院特产研究所吉林省左家镇药用植物资源圃提供，经特产所刘继永研究员鉴定为百合科黄精属黄精（Polygonatum sibiricum）的根茎。
试剂：盐酸（北京化工厂，优级纯）；
苯酚（国药集团，分析纯）；
氨基酸混合标准液（H型，日本Woke公司）；
超纯水（电阻率≥18.2）。
2.1 氨基酸混合标准溶液配制
2.2 前处理方法
样品经高速粉碎机粉碎，过60目筛，备用。
常规水解法：称取0.1 g样品于水解管中，准确加入10 mL 6 mol/L的盐酸溶液，将水解管放入冷冻剂中冷冻5 min，抽真空后充入氮气，重复抽真空 充入氮气3次后，在充氮气状态下拧紧螺丝盖，110℃恒温干燥箱水解22 h，水解液冷却至室温后将其全部过滤至50 mL容量瓶内，超纯水定容。准确吸取1.0 mL水解液于玻璃试管中，70℃减压干燥，用2.0mL0.02mol/L的盐酸溶液复溶，涡旋混匀，过0.22m水系滤膜，上机待测。
微波水解氨基酸法：称取0.1 g样品于专用微波消解罐中，准确缓慢加入10 mL 6 mol/L的盐酸溶液，消解罐密封，按试验设计设定微波消解仪的温度和时间，进行消解。消解结束后，待水解液冷却至室温后，将全部水解液过滤至50 mL容量瓶内，超纯水定容。准确吸取1.0mL水解液于玻璃试管中，70℃减压干燥，用2.0 mL 0.02 mol/L盐酸溶液复溶，涡旋混匀，过0.22m水系滤膜，上机待测。
2.3 仪器工作参数
色谱柱：4.6 mm id 60 mm；
填充物：磺酸型阳离子树脂；
检测波长：570 nm、440 nm；
进样量：20L；
泵1流速：0.1 mL/min，泵2流速：0.1 mL/min；
色谱条件：全自动氨基酸分析仪色谱条件见表1，其中B1-B4为柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠、氢氧化钠和乙醇按一定比例混合配制成的pH分别为1、2、3、4的缓冲溶液，用于将阳离子交换柱上的氨基酸按吸附力强弱在不同时间洗脱出来，达到分离氨基酸的目的。洗脱下来的氨基酸则与茚三酮反应液（R1-R3）在135℃加热的条件下反应，分光光度计于570 nm和440 nm测定，外标法定量。
表1 色谱条件Table 1 The chromatographic conditions
续表
3.1 常规水解法与微波水解法的结果比较
采用“2.2”中的2种氨基酸水解方法处理同一个黄精样品，结果显示，除胱氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸及赖氨酸的检出量微波水解测定值略低于常规水解外，其他氨基酸含量基本相同；
常规水解与微波水解法所测得的氨基酸总量分别为5.75%和5.60%，差值不足0.2%，微波水解的前处理方法完全能够满足黄精中氨基酸含量测定的要求，且与常规方法相比能够节省提取时间，提高工作效率，因此，黄精中氨基酸含量测定可选择微波水解法，见图1。
图1 常规水解与微波水解的比较Fig.1 Comparison of conventional hydrolysis and microwave hydrolysis
3.2 微波水解条件优化
3.2.1 微波水解温度优化 在微波功率1 000 W、水解时间18 min固定不变的情况下，分别考察水解温度为130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃时野生黄精样品中各氨基酸含量的变化情况。结果见表2：总氨基酸含量随水解温度的升高逐渐增大，170℃时总氨基酸含量达到最大，为5.573 2 g/100 g，温度继续升高至200℃时总氨基酸含量逐渐降低至5.390 8 g/100 g。其中天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸在温度升高过程中检出量明显增大，170℃时达到最高，高于170℃后逐渐平稳。
表2 不同微波水解温度条件下的氨基酸含量Table 2 The content of amino acid under different microwave hydrolysis temperature
结果显示，随着温度的升高，氨基酸检出量呈现出先上升后下降的趋势。其中，胱氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的检出量受温度影响较大，随着温度的升高，5种氨基酸的检出量逐渐升高；
170℃时，其氨基酸的检出量最大；
温度继续升高，这些氨基酸在一定程度上被破坏，检出量不断降低；
其他氨基酸检出的结果受影响程度不明显。因此，确定170℃为微波水解氨基酸的最佳温度。
3.2.2 微波水解时间优化功率1 000 W、水解温度170℃的情况下，分别考察8min、10min、12min、14min、16 min、18 min、20 min和22 min条件下氨基酸含量的变化情况。结果显示，随着其微波水解的时间不断延长，谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸出现了先升高后降低的变化，当水解时间为14 min时，检出量最大。因此，选择最佳微波水解时间为14min。
3.3 方法的精密度、稳定性及重复性
取“2.2”项下微波消解法（微波功率1 200 W，水解温度170℃，水解时间14 min）制备的供试样品溶液，经过连续进样6次，17种氨基酸的相对标准偏差RSD（n=6）范围为0.26%~2.7%。将上述供试样品室温下存放0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后测定17种氨基酸峰面积的RSD（n=7）＜4.2%。取同一黄精样品，按“2.2”微波消解法（微波功率1 200 W，水解温度170℃，水解时间14 min）制备6份供试样品溶液，测定各氨基酸色谱峰面积，RSD%（n=6）为0.21%~3.6%；
氨基酸总量平均值为5.71 g/100g，RSD%为0.51%。上述结果表明，该方法的稳定性好、精密度高、重现性良好，能够用于黄精中的17种氨基酸的检测分析。
3.4 加标回收率
准确称取6份0.1 g（精确至0.000 1 g）黄精样品，加入一定量氨基酸的混合标准溶液，利用微波水解法检测氨基酸的含量，计算其回收率。如表2所示，黄精中各氨基酸的平均加标回收率在83.0%~108.2%之间，RSD%（n=6）为0.51%~3.91%。该方法测定黄精中氨基酸含量的加标回收率良好，准确性高。
表3 水解黄精中的17种氨基酸的含量、回收率及相对标准偏差Table 3 The contents，recoveries and RSD of 17 kinds of amino acids in Polygonatum sibiricum
3.5 野生黄精与林下黄精氨基酸含量测定
采用微波水解法，通过全自动氨基酸分析仪分别测定了野生黄精和林下黄精的氨基酸含量，结果显示，野生黄精氨基酸含量高于林下黄精，总量分别为5.60%和4.15%，其中精氨酸的含量最高，分别为1.70%和1.23%，占氨基酸总量的25%以上。
本试验采用加热水解法和微波水解法测定了黄精中17种氨基酸的含量，并对结果进行了对比分析。研究表明，黄精样品在微波功率为1 200 W、170℃条件下微波水解14 min时，可与常规加热水解法达到相同的效果，且该方法操作简单、耗时短且安全性高，可以有效降低检测成本。微波水解法测定黄精中17种氨基酸的准确度、重现性和稳定性都很好，可用于黄精和其他中药材中的氨基酸检测。
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