陈 沛 杨元金 杜合军 杨 菁 张德志 胡子宣 李 洋*
(1.中国长江三峡集团有限公司，中华鲟研究所，宜昌443100；
2.三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室，宜昌443100)
过度捕捞、环境污染和涉水工程等人类活动造成中华鲟(Acipensersinensis)自然种群规模急剧下降，因而在1988年，中华鲟作为一级保护对象被列入国家重点保护野生动物名录中[1]。截至2022年，相关放流单位累计放流中华鲟的数量不足800万尾，其达到有效补充自然种群的放流规模还远远不够。近年来，随着人工繁殖技术的突破，中华鲟人工养殖规模也逐渐扩大，这加快了大规模人工增殖放流及中华鲟自然种群快速恢复的步伐[2]。
自然条件下，中华鲟仔鱼在出膜后12～15 d，以寡毛类、枝角类(蚤状、隆线蚤等)和摇蚊幼虫等活饵料为主要的开口饵料[3]。但由于仔鱼各器官分化不成熟，功能不完全，若开口饵料选择不当，极易影响鱼体生长发育，出现发病和死亡[4]。西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)仔鱼配合饲料驯养的成功，为鲟鱼摄食人工饲料和集约化养殖奠定了基础[5]。随后，关于高首鲟(Acipensertransmontanus)[6]、意大利鲟(Acipensernacarii)[7]、湖鲟(Acipenserfulvescens)[8]、中华鲟[3,9-10]、尖吻鲟(Acipenseroxyrinchus)[11]、施氏鲟(Acipenserschrenckii)[12]、波斯鲟(Acipenserpersicus)[13]、小体鲟(Acipenserruthenus)[14]和西伯利亚鲟[15]仔鱼开口饵料的研究有很多报道，结果表明，以水蚯蚓(克拉泊水丝蚓，Limnodrilusclaparedeianus)或卤虫无节幼体(Artemianauplii)为主的天然饵料更适合作为鲟仔鱼的开口饵料。尽管摄食人工配合饲料的鲟仔鱼成活率低、生长速度慢，但由于集约化养殖的发展，目前配合饲料在鲟鱼开口期中的使用也越来越普遍[5-6,16]。
目前，由于水蚯蚓供给源头的不稳定性、自身携带病原菌以及环保等问题，这严重阻碍了中华鲟开口饵料的供应，制约了大规模中华鲟苗种培育的进程[3,9]。因此，在安全可控的条件下，研发一种替代水蚯蚓的中华鲟仔稚鱼配合饲料迫在眉睫。目前，关于中华鲟仔鱼营养需和饲料配方的报道还很少，只有邓昕等[3]和曹志华等[10]分别用商业Biodiet饲料和“升索牌”鱼苗专用微粒子饲料进行中华鲟开口试验研究，结果发现饲料组鱼的生长性能和成活率都很低。为此，本研究以水蚯蚓作为对照，探讨配合饲料对中华鲟开口仔鱼生长性能、消化酶活性以及抗氧化和免疫功能的影响，为后期中华鲟规模化苗种培育过程中配合饲料的研发提供科学依据与数据支持。
1.1 试验设计及饲养管理
选取2021年10月在中华鲟研究所宜昌试验站人工繁育孵化出膜的中华鲟子二代仔鱼(开始沉底，有摄食行为)为研究对象，选择体质健壮、规格齐整的1 200尾中华鲟仔鱼作为试验鱼，平均体重为(86.57±3.05) mg，平均体长为(28.40±0.28) mm。试验设置水蚯蚓组(对照组)和开口饲料组(试验组)，每组3个重复，每个重复200尾，置于135 L的方形玻璃缸内。水蚯蚓放在流水槽中暂养3 d以上，在投喂前用搅拌机搅碎成0.5～2.0 mm后过75目筛后使用。完成配料后，先加入适量水进行微黏合，之后在喷雾干燥机中制作粒径为0.25～0.38 mm的微颗粒饲料，此配方由中国农业科学院饲料研究所提供，受专利保护(申请号：CN201410098997.9)。开口饵料组成及营养水平见表1和表2。
表1 开口饵料组成及营养水平(干物质基础)
表2 开口饵料的氨基酸组成
本试验采取饱食投喂，每日08:30、11:30、14:30和18:30各投喂1次。投喂前关掉养殖缸内循环系统，摄食30 min后，及时清理残饵，在开启循环系统。每天换水1次，换水量为养殖水体的1/3，并记录死苗情况，养殖周期为9 d。试验期间，水温维持在19.0～20.5 ℃，光照时间每天08:00—20:00，pH=7.0～7.5，溶解氧浓度>7 mg/L，氨氮浓度<0.2 mg/L。
1.2 检测指标及方法
1.2.1 样品采集
试验结束后，所有试验鱼饥饿24 h，经2-苯氧基乙醇(Sigma)麻醉后进行称重及计数。在每个组中随机选取20尾鱼，对其体长和体重(抹干重)进行测量。每组随机选取10尾鱼，装于冻存管中，液氮速冻后于-80 ℃保存，用于测定鱼体匀浆的生理指标以及消化酶活性。
1.2.2 生长指标测定
生长指标的计算方法如下：
体长特定生长率(%/d)=100×(ln终末
鱼体长-ln初始鱼体长)/试验天数；
体重特定生长率(%/d)=100×(ln终末鱼重-
ln初始鱼重)/试验天数；
成活率(%)=100×存活鱼尾数/
试验开始鱼尾数；
增重率(%)=100×(终末鱼重+死鱼重-
初始鱼重)/初始鱼重。
1.2.3 营养成分测定
饵料的营养成分参考国标方法，分别为：水分采用105 ℃烘箱干燥恒重法检测(GB/T 6435—2014)，粗蛋白质采用凯氏定氮仪检测(GB/T 6432—2018)，粗脂肪采用氯仿-甲醇法检测(GB/T 6433—2006)，粗灰分采用550 ℃马弗炉灼烧法检测(GB/T 6438—2007)；
氨基酸组成(17种氨基酸)采用AB Sciex QTRAP 6500质谱仪和AB SciexExionLCTMAD液相色谱分析测定(GB/T 18246—2000)；
脂肪酸采用Agilent 7890A/5975C气质联用仪进行质谱分析(GB/T 20195—2006)。
1.2.4 生理指标和消化酶活性测定
将全鱼用液氮研磨后，加入9倍体积的磷酸盐缓冲液(PBS，mL/g)进行振荡，4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，取上清液用于生理指标测定。总蛋白(TP,A045-2-2)、葡萄糖(F006-1-1)、谷丙转氨酶(ALT,C009-3-1)、谷草转氨酶(AST,C010-3-1)、甘油三酯(TG,A110-2-1)，总胆固醇(TC,A111-2)、非酯化游离脂肪酸(NEFA,A042-2-1)、碱性磷酸酶(AKP,A059-3-1)、总胆汁酸(TBA,E003-2-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C,A113-2-1)、总抗氧化能力(T-AOC,A015-2-1)、还原性谷胱甘肽(GSH,A006-2-1)、超氧化物歧化酶(SOD,A001-3-2)、过氧化氢酶(CAT,A007-1-1)和丙二醛(MDA,A003-1-2)等指标参照南京建成生物工程研究所试剂盒检测；
活性氧(ROS,ml710244)、淀粉酶(ml036449)、蛋白酶(ml729843)、脂肪酶(ml036371)、免疫球蛋白G(IgG,ml036423)、免疫球蛋白M(IgM,ml710594)、免疫球蛋白Z(IgZ,ml723025)和溶菌酶(ml036413)等指标采用上海酶联生物科技有限公司的试剂盒检测。检测步骤参考试剂说明书进行。
1.3 数据统计与分析
试验结果用平均值±标准误(mean±SE)的形式表示，使用SPSS 26.0软件中的独立样本t检验进行组间比较，P<0.05表示差异显著。
2.1 开口饲料对中华鲟仔鱼生长性能及成活率的影响
开口饲料对中华鲟仔鱼生长性能及成活率的影响见表3。由表可知，开口饲料组中华鲟仔鱼的终末体重、终末体长、增重率、体长特定生长率和体重特定生长率均显著低于水蚯蚓组(对照组，P<0.05)；
开口饲料组存活率低于水蚯蚓组，但两者之间无显著差异(P>0.05)。
表3 开口饲料对中华鲟仔鱼生长性能的影响
2.2 开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼消化酶活性和生理指标的影响
开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼消化酶活性的影响见表4。由表可知，与水蚯蚓组相比，开口饲料组鱼体淀粉酶、脂肪酶和AKP活性显著提高(P<0.05)；
开口饲料组鱼体蛋白酶活性低于水蚯蚓组，但两者之间无显著差异(P>0.05)。
表4 开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼消化酶活性的影响
开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼生理指标的影响见表5。由表可知，开口饲料组鱼体TP含量显著低于水蚯蚓组(P<0.05)，TBA含量显著高于水蚯蚓组(P<0.05)；
与水蚯蚓组相比，开口饲料组鱼体TG、TC、LDL-C含量及AST和ALT活性有所提高，葡萄糖和NEFA含量有所降低，但均无显著差异(P>0.05)。
2.3 开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼抗氧化和免疫指标的影响
开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼抗氧化和免疫指标的影响见表6。由表可知，与水蚯蚓组相比，开口饲料组鱼体ROS和MDA含量显著提高(P<0.05)，SOD活性和T-AOC显著降低(P<0.05)，而GSH含量和CAT活性无显著差异(P>0.05)；
此外，开口饲料组鱼体溶菌酶活性以及IgG和IgM含量显著提高(P<0.05)。以上结果表明，中华鲟仔鱼能通过提高自身的免疫功能，缓解开口饲料引起的氧化应激。
鲟科鱼类从摄食活饵料(如水蚯蚓、卤虫无节幼体和浮游动物等)转换为人工饲料时，因大多数仔鱼拒绝摄食，通常会出现较差的生长性能和较高的死亡率[4]。中华鲟是摄食底栖动物为主的肉食性鱼类，从摄食天然饵料到配合饲料驯化阶段是人工养殖的关键时期，目前关于配合饲料直接进行开口的报道还相对较少。邓昕等[3]报道，中华鲟开口期投喂配合饲料，15 d后饲料组仔鱼平均末重为水蚯蚓组的0.22倍，成活率为30.8%；
经过10 d的开口饲料投喂，曹志华等[10]发现，开口饲料组中华鲟仔鱼末重为水蚯蚓组的0.17倍，而成活率仅有11.0%；
叶继丹等[9]研究表明，开口饲料投喂30 d后，中华鲟仔鱼末重为水蚯蚓组的0.73倍，成活率可达48.3%。在本研究中，开口饲料饲喂9 d，中华鲟仔鱼末重为水蚯蚓组的0.72倍，而成活率高达82.11%，这可能与开口饲料诱食性差导致其摄入量少，或是开口饲料的营养成分不能满足其生长需求有关[6]。而先投喂水蚯蚓7 d，由于中华鲟仔鱼消化功能得到进一步加强，再用饲料进行驯化会相对容易[9]。与水蚯蚓相比，开口饲料的总氨基酸、必需氨基酸和鲜味氨基酸含量都偏低，因此，开口饲料的营养不均衡导致仔稚鱼早期消化发育阶段缺乏一些至关重要的营养素[4,17]。先前研究表明，开口饲料显著降低中华鲟仔鱼成活率[3,9-10]，而本研究发现开口饲料并没有显著影响中华鲟仔鱼成活率。中华鲟仔鱼开口后，延迟投喂12 d以上才发生不可逆转饥饿，鱼体在短时间内还可以自身营养物质继续存活[18]，因此，本研究开口饲料组中华鲟仔鱼高存活率与养殖周期密切有关。
表5 开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼生理指标的影响
表6 开口饲料对中华鲟仔鱼全鱼抗氧化和免疫指标的影响
梁旭方等[19]通过对中华鲟摄食行为和皮肤感觉器官结构分析发现，中华鲟幼鱼[初始体重(32.7±5.7) g]喜欢摄食水蚯蚓的原因可能与水蚯蚓发出的电觉刺激信号有关，而配合饲料仅具有好的味觉刺激因子，不存在电觉刺激信号，这可能是中华鲟幼鱼转食人工配合饲料不成功的重要原因。后期研究发现，驯化配合饲料成功的中华鲟幼鱼(体长15～27 cm)口腔内味蕾数量远高于未驯化成功的[20]；
与已经摄食过水蚯蚓的高首鲟仔鱼相比，在开口期直接用配合饲料进行驯化的高首鲟更容易摄食饲料[18,21]，从以上结果可以推测，鲟鱼可通过调节自身味觉系统来应对只具有味觉刺激因子的配合饲料。Xiao等[22]研究发现，以6%投喂率(g鱼体重/d)养殖中华鲟幼鱼(初始体重3.8 g)42 d后，饲料组的鱼体重可以追上水蚯蚓组；
中华鲟在开口期直接投喂饲料，30 d后饲料组仔鱼末重可达水蚯蚓组的0.73倍，但饲料组鱼苗摄食积极迅速，胃肠充塞度大[9]，以上结果表明开口期中华鲟在一定程度上能适应配合饲料。
早期鱼类发育过程中，消化酶活性的强弱对鱼类消化吸收、正常的新陈代谢、早期存活和生长关系具有重要的影响[4]。在开口前，中华鲟仔鱼的胃、肝脏、胰脏、十二指肠、直肠和肛门等消化器官基本发育完善，而且蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶均达到一个最高值，因此，中华鲟开口后具备利用生物饵料或配合饲料的能力[23]。中华鲟早期主要摄食一些脂肪含量丰富的水生动物来满足机体较高的能量需求，因此，在开口阶段较高的脂肪酶活性可以提高中华鲟对高脂肪饵料的吸收与利用[4,24]。与这结果相似的是，本研究结果发现，中华鲟仔鱼摄食高脂肪含量的开口饲料后，引起全鱼的脂肪酶活性显著提高，且与脂代谢相关的TG、TC、TBA含量和AKP活性含量都升高，进一步说明中华鲟早期喜爱摄食高脂生物饵料。AKP通过磷酸化修饰可以提高消化酶的活性，可以预示消化系统的发育水平[25]。随着匙吻鲟仔鱼发育时间的延长，稚鱼肠道AKP活性逐渐升高[26]。黄颡鱼(Peltobagrusfulvidraco)仔鱼摄食饲喂动物性饵料蝇蛆，鱼体AKP活性显著提高，有助于其消化系统的发育[27]。本研究发现，开口饵料能显著提高鱼体AKP活性，提示中华鲟仔鱼可以较好地利用开口饲料。从以上结果可以推断，中华鲟可以通过调节自身消化酶活性实现对开口饲料的吸收和利用[23]。而水蚯蚓组中华鲟仔鱼体现出的高生长性能，可能由于水蚯蚓适口性比开口饲料好，更适合鲟仔鱼消化酶组成[28]。此外，在本试验中，开口饲料诱食性差可能是影响中华鲟仔鱼生长性能的主要原因，以后如何进一步将味觉发育系统与饲料诱食性密切的关联，阐明两者间的相互作用，可能是未来中华鲟开口饲料研发的重点。
与水蚯蚓相比，开口饲料诱食性差会降低中华鲟仔鱼生长性能，但中华鲟仔鱼在一定程度上可以通过提高自身消化酶活性及机体免疫力来适应开口饲料。
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