陈佳雯 海思娆 马 立 裘 知 韩梦怡 王晨龙 冯士彬 赵 畅 王希春
(安徽农业大学动物科技学院，合肥230036)
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)是由镰刀菌属真菌产生的一种霉菌毒素，广泛污染谷物与饲料[1]。当哺乳动物误食被ZEA污染的饲料后，主要产生生殖毒性，造成繁殖性能和生产性能降低[2]。有研究表明，ZEA可通过核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)信号通路诱导猪生殖细胞氧化损伤和凋亡[3-4]；
ZEA对小鼠精原细胞具有毒性作用，可引起细胞凋亡与自噬[5]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是单端孢霉烯B族中最具代表性的一种霉菌毒素。DON暴露可引起BALB/c小鼠精子损伤、氧化应激、睾丸细胞凋亡和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/c-Jun信号通路磷酸化[6]。在细胞水平上，DON的主要毒性作用是破坏线粒体、内质网等细胞器结构，引起细胞膜破裂，抑制蛋白质和核酸的合成，并通过诱导细胞凋亡发挥毒性效应[7]。自然情况下，ZEA和DON在饲料中常共同存在。许多研究显示，ZEA与DON具有一定的互作效应，ZEA与DON联合处理会影响小鼠睾丸间质细胞生殖激素的分泌[8]；
ZEA与DON可通过线粒体途径诱导仔猪睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)凋亡，且联合毒性大于单一毒性[9]。
近年来，线粒体与内质网之间的相互作用已成为细胞生物学的研究热点[10]。线粒体与内质网之间存在一个结构域为线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAM)，其在调节细胞钙稳态、磷脂合成、细胞凋亡、线粒体动力学以及内质网应激等方面均发挥着重要的作用[11]。有研究表明，凋亡诱导因子刺激时，多功能分选蛋白2(multifunctional sorting protein 2，PACS2)与去磷酸化的BH3结构域凋亡诱导蛋白(BH3 interacting-domain death agonist，Bid)结合，并将凋亡信号从内质网运输至线粒体中[12]。同时，线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1，Fis1)与B细胞受体相关蛋白31(B-cell receptor-associated protein 31，Bap31)相互作用，通过胱天蛋白酶-8(procaspase-8)促进其分裂为促凋亡的p20 Bap31，从而将凋亡信号从线粒体传递至内质网[13]。但是，线粒体是否调控ZEA与DON联合染毒仔猪SCs过程中内质网应激介导的凋亡，目前研究较少。因此，本研究以仔猪SCs为模型，通过添加线粒体分裂抑制剂——线粒体分裂抑制因子-1(mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1)抑制线粒体分裂，研究线粒体在ZEA与DON联合染毒仔猪SCs过程中对内质网途径凋亡的调控作用机制，为ZEA与DON生殖毒性危害的解除提供理论依据。
1.1 试验材料
1.1.1 试验试剂
ZEA、DON标准品均购自美国Sigma公司；
SCs购自上海青旗生物技术发展有限公司；
DMEM高糖培养基购自上海源培生物科技股份有限公司；
Mdivi-1购自TargetMol生物公司；
0.25%胰蛋白酶消化液购自武汉赛维尔生物科技有限公司；
二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自Sparkjade公司；
膜联蛋白Ⅴ的异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；
β-肌动蛋白(β-actin)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和真核生物翻译起始因子2α(eIF2α)抗体均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。
1.1.2 试验仪器
BB-15二氧化氮(CO2)恒温培养箱(美国Thermo公司)；
Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo公司)；
FACS Calibar流式细胞仪(美国BD公司)；
TEOL-2010透射电子显微镜(日本电子株式会社)；
2500凝胶成像仪(美国Thermo公司)；
荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)。
1.2 细胞培养和传代
从-80 ℃冰箱中取出SCs，迅速置于37 ℃恒温水浴锅，按细胞冻存液与培养基1∶9配制后离心，去上清，并加入4 mL新鲜培养基，转移到4 cm×6 cm细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中；
待细胞贴壁至80%，用胰酶消化细胞至60%后加培养基终止消化，离心后去上清，重悬细胞置于细胞培养箱中。
1.3 ZEA与DON及Mdivi-1浓度筛选
将细胞按密度8 000个/孔接种于96孔板，培养24 h后将ZEA与DON按照浓度梯度[ZEA+DON分别为(0+0)(对照)、(15+0.4) μmol/L、(30+0.8) μmol/L、(30+1.2) μmol/L、(45+1.8) μmol/L、(60+2.4) μmol/L和(80+4.8) μmol/L]处理细胞，24 h后用CCK-8法检测细胞活率，探索半数抑制浓度。重复操作将细胞接种到96孔板，按照浓度梯度添加Mdivi-1[0(对照)、0.1、0.5、1.5、5、10和15 μmol/L]预处理细胞，2 h后添加此前测得的半数抑制浓度的ZEA+DON，探索Mdivi-1的最适浓度。每组设置3个重复，下同。
1.4 仔猪SCs存活状态观察
将细胞按密度8 000个/mL接种于24孔板，培养24 h后根据分组处理24 h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次细胞，根据Cytotoxicity Assay Kit说明书添加Calcein AM/PI检测工作液，37 ℃条件下避光孵育30 min，通过荧光光学显微镜观察细胞存活状态并拍照记录。
1.5 细胞超微结构、线粒体及内质网形态观察
将细胞按密度8 000个/mL接种于6孔板，培养24 h后根据分组处理24 h，PBS冲洗，离心后去上清，缓慢加入2.5%戊二醛；
固定24 h后置于PBS 6 h，再转移至1%锇酸固定2 h；
再将样本置于乙醇中进行梯度脱水、包埋、加热、切片和染色后用透射电子显微镜观察细胞、线粒体及内质网结构。
1.6 细胞凋亡率检测
取对数生长期的细胞，按每孔24万个细胞接种在6孔板，培养至融合率达到50%后，按照分组添加ZEA、DON及Mdivi-1处理24 h，采用Annexin V-FITC/PI试剂盒处理后1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.7 内质网途径凋亡相关基因mRNA相对表达量测定
按上述方法接种细胞并处理24 h后，采用TRIzol法提取RNA，并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。根据GenBank相关序列设计合成目的基因PERK、ATF4、CHOP、eIF2α及内参基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的引物序列，引物序列见表1。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应程序：95 ℃ 1 min，(95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min)×40个循环。采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。
表1 引物序列
1.8 内质网途径凋亡相关蛋白相对表达量测定
按上述方法接种细胞并处理24 h后去除培养基，用PBS清洗1遍后加入RIPA快速裂解液，用枪吹打数下使细胞充分裂解，再以14 000×g离心10 min后收集上清液。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，将提取的蛋白样品煮沸8 min，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、封闭、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜后进行凝胶成像。
1.9 数据处理
采用SPSS 20.0软件中的ANOVA程序进行方差分析，并采用LSD法进行显著性检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著；
采用GraphPad Prism 9.0绘制柱状图。
2.1 ZEA与DON对仔猪SCs存活率的影响及Mdivi-1浓度的确定
如图1-A所示，与对照相比，当ZEA+DON浓度为(30+0.8) μmol/L时，可极显著降低细胞存活率(P<0.01)，且细胞存活率随着ZEA+DON浓度的升高而降低，呈剂量依赖性关系，并在ZEA+DON浓度为(30+1.2) μmol/L时，细胞存活率在50%附近，故选择ZEA+DON浓度为(30+1.2) μmol/L进行后续试验。
如图1-B所示，当Mdivi-1浓度为1.5 μmol/L时，对细胞基本无损伤作用，同时也能达到极显著缓解ZEA与DON对细胞的损伤作用(P<0.01)，故选择此浓度进行后续试验。
与对照处理相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下图同。
2.2 仔猪SCs存活状态
采用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)/PI染色检测ZEA与DON对仔猪SCs细胞死亡的影响。活细胞被非荧光Calcein-AM染成绿色，死亡细胞或细胞膜受损的细胞被PI染成红色。如图2所示，对照和Mdivi-1处理绿色荧光分布均匀且荧光较强；
当细胞暴露于ZEA与DON中，红色荧光增强，表明ZEA与DON可致仔猪SCs死亡；
当添加Mdivi-1预处理后，ZEA+DON+Mdivi-1处理红色荧光明显较少且绿色荧光增多，表明Mdivi-1能够缓解ZEA与DON引起的仔猪SCs死亡。
图2 仔猪SCs存活状态的变化
2.3 仔猪SCs超微结构及内质网形态变化
如图3所示，对照处理细胞饱满，线粒体嵴清晰可见，内质网数量较多且结构完整；
Mdivi-1处理细胞较饱满，线粒体与内质网结构基本无损伤；
ZEA+DON处理细胞破裂，染色质贴近核膜，核膜损伤，内质网断裂且边缘模糊，线粒体数量减少、肿胀并出现空泡变性；
与ZEA+DON处理相比，ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡有所缓解，线粒体结构较清晰，内质网断裂有所改善。
图3 仔猪SCs超微结构的变化
2.4 仔猪SCs凋亡率
如图4所示，与对照处理相比，ZEA+DON处理细胞凋亡率极显著提高(P<0.01)，Mdivi-1处理细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)；
与ZEA+DON处理相比，ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡率极显著降低(P<0.01)。
与ZEA+DON处理相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)。下图同。
2.5 内质网途径凋亡相关基因mRNA相对表达量
在细胞中添加Mdivi-1，探究线粒体是否调控ZEA与DON诱导仔猪SCs的内质网途径凋亡，并通过qRT-PCR法分别检测内质网途径引起的凋亡相关基因的mRNA相对表达量，结果如图5所示。与对照处理相比，ZEA+DON处理PERK、ATF4、CHOP和eIF2αmRNA相对表达量均极显著提高(P<0.01)，而Mdivi-1处理各基因mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)；
但与ZEA+DON处理相比，ZEA+DON+Mdivi-1处理内质网途径凋亡相关基因mRNA相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。以上试验结果显示，线粒体参与了调控ZEA与DON诱导的仔猪SCs内质网途径凋亡。
图5 仔猪SCs内质网途径凋亡相关基因mRNA相对表达量
2.6 内质网途径凋亡相关蛋白相对表达量
Western blot结果如图6所示，与对照处理相比，ZEA+DON处理PERK、ATF4、CHOP和eIF2α蛋白相对表达量均极显著提高(P<0.01)，而Mdivi-1处理各蛋白相对表达量均无显著差异(P>0.05)；
但与ZEA+DON处理相比，ZEA+DON+Mdivi-1处理内质网途径相关凋亡蛋白相对表达量均极显著降低(P<0.01)。以上试验结果再次验证，线粒体参与了调控ZEA与DON诱导的仔猪SCs内质网途径凋亡。
图6 仔猪SCs内质网途径凋亡相关蛋白相对表达量
目前，霉菌毒素是动物饲料安全的主要威胁之一，但由于霉菌毒素的叠加毒性和危害研究不多，导致其在畜牧业的危害常被忽视。其中，ZEA与DON对猪最为敏感，研究表明，ZEA与DON均可通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)引起生殖细胞凋亡。王宗捷等[14]在ZEA处理的山羊子宫内膜基质细胞中添加ERS特异性抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)，可显著其凋亡率；
此外，Fu等[15]发现，4-PBA可显著降低ZEA诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡；
DON刺激导致ERS相关蛋白的丰度增加，从而诱导刺激牛卵巢卵膜细胞凋亡[16]；
Wang等[17]发现，蒲公英甾醇可缓解DON诱导牛乳腺上皮细胞ERS引起的凋亡。本试验以仔猪SCs为模型，用ZEA与DON联合染毒仔猪SCs后，凋亡率极显著上升，且ERS引起的凋亡基因PERK、ATF4、CHOP、eIF2αmRNA相对表达量和PERK、ATF4、CHOP、eIF2α蛋白相对表达量均极显著上调，这表明ZEA与DON诱导仔猪SCs通过ERS引起凋亡，试验结果与上述报道保持一致。
细胞器互作是近年来细胞生物学的研究热点之一。内质网是真核细胞里最大的细胞器，弥散分布在整个胞质区域，在细胞蛋白质和脂质的合成、钙信号调控等过程中发挥了重要的作用[18]。当内质网腔内错误折叠的蛋白质堆积，内质网的蛋白质折叠需求被淹没时，内质网就会发生应激。ERS通过减少蛋白质翻译，启动未折叠蛋白反应(UPR)来恢复体内平衡，如果细胞受到不可修复的损伤，则启动细胞凋亡[19]。线粒体是细胞中制造能量的主要结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。线粒体和内质网之间存在动态的膜接触位点，即MAM，MAM上存在着多种跨膜蛋白，在线粒体和内质网之间搭建了一个复杂的物理空间结构，此结构为线粒体和内质网之间的相互调节提供了平台[20]。MAM的作用不可忽视，其参与调控ERS、钙稳态、胆固醇和磷脂代谢、线粒体功能和动力学以及细胞凋亡等[21-22]。有研究表明，线粒体和内质网可以通过耦联区域互相传递凋亡信号[12-13]。比如，抑制ERS可以影响线粒体融合和分裂，导致线粒体抗凋亡性增强[23]；
Wu等[24]发现，线粒体分裂导致ERS凋亡关键蛋白CHOP和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)水平均显著提高，从而诱导ERS引起细胞凋亡；
Xie等[25]通过添加Mdivi-1抑制ERS标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CHOP表达及Caspase-3的激活降低海马神经元凋亡率。因此，本试验以仔猪SCs为模型，采用ZEA与DON联合染毒仔猪SCs，并添加Mdivi-1，结果显示Mdivi-1可以缓解ZEA与DON联合染毒仔猪SCs引起的细胞超微结构、线粒体和内质网损伤，显著或极显著降低ERS引起的凋亡基因PERK、ATF4、CHOP、eIF2αmRNA相对表达量和PERK、ATF4、CHOP、eIF2α蛋白相对表达量以及细胞凋亡率的提高，表明线粒体可能通过干扰ERS凋亡通路，参与ZEA与DON联合染毒诱导仔猪SCs凋亡，这与上述报道保持一致。
添加ZEA与DON染毒仔猪SCs可引起内质网途径凋亡，而添加Mdivi-1后可明显缓解细胞超微结构及线粒体和内质网的损伤，极显著降低细胞凋亡率，显著或极显著下调内质网途径凋亡相关基因和蛋白的表达。结果提示，线粒体作为内质网途径凋亡的上游参与了ZEA与DON联合染毒诱导的仔猪SCs凋亡，干预该过程可以为霉菌毒素生殖毒性危害的解除提供新思路。
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