于官正，李 鸿，涂 星
(1.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000；
2.湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心，湖北 恩施 445000)
腹泻型肠易激综合征（diarrhea predominant-irritable bowel syndrome，IBS-D）是一种以腹痛、腹泻为主要临床特征的肠道功能紊乱性疾病，发病机制尚未明确，可能与肠上皮屏障通透性升高、内脏高敏感性、脑-肠轴功能失调等相关[1]。临床治疗IBS-D 常使用解痉、止泻等药品，疗效单一且价格昂贵[2]。中医认为IBS-D 属于“腹泻”“下利”等范畴，基本病机为脾失健运、肝郁脾虚等，常采用益气健脾、疏肝健脾等方法进行治疗[3]。四君子汤与痛泻要方为治疗IBS-D 的经典方，四君子汤以人参为君药，偏于益气健脾，痛泻要方以白术为君药，偏于燥湿止泻，体现了“同病异治”的中医特色，但其治疗IBS-D 的共性机制尚不明确[4]。网络药理学从整体上分析中药复方多成分、多靶点、多通路的调节机制，与中医整体观念与辨证论治思想相契合，为中医学“同病异治”的观点的阐述提供有效途径[5，6]。本研究通过网络药理学预测四君子汤与痛泻要方治疗IBS-D 潜在共性靶点与通路，拟探究两复方“同病异治”IBS-D 的潜在共性机制，以期为临床治疗IBS-D 用药提供理论支撑。
1.1 软件及数据库 Cytoscape（3.7.2）；
Java（1.8.0）；
Perl 语言（Active Perl 5.30）；
R 语言（x64 4.2.1）；
Bioconductor 平 台（https://www.bioconductor.org，version3.15）；
中药系统药理分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/index.php，version2.3）；
Gene Expression Omnibus 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GEO 数据库）；
STRING 数据库（http://string-db.org/，version 11.5）。各数据库的检索均于2022 年12 月12 日完成。
1.2 筛选疾病差异基因 于GEO 数据库中输入diarrhea-predominant irritable bowel syndrome normal，物种选择“Homo sapiens”进行搜索，IBS-D 基因载于GSE6701 芯片，该芯片数据由77 个健康受试者和53 个IBS-D 患者基因表达量构成[7]。下载该芯片的平台文件与探针文件。借助Perl 语言将探针名称转化为基因名称并进行分组。以健康组和IBS-D 组基因差异倍数的绝对值（|logFC|）≥1 且p＜0.05 为标准，运用R 语言分析基因数据的差异性，筛选疾病差异基因并绘制火山图。
1.3 预测复方活性成分及靶点 于TCMSP 数据库中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥0.30、类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为条件进行检索[8，9]，获取四君子汤与痛泻要方的活性成分及对应靶点。运用Perl 语言进行药物靶点ID 转化，将靶点名转为对应的基因名。
1.4 构建中药复方调控网络 将1.3 获得的两复方作用靶点基因与IBS-D 差异基因绘制Venn 图，取交集；
运用Perl 语言呈现出交集基因对应的活性成分；
运用Cytoscape 软件绘制中药复方调控网络并进行拓扑分析[10]。
1.5 PPI 网络分析 将1.4 得到的交集基因录入STRING 数据库，选择“Multiple proteins”，物种选择“Homo sapiens”，将游离蛋白点隐藏后更新构建PPI网络，通过R 语言运行脚本及PPI 网络TSV 文件，按照基因富集数目由多至少为条件筛选排名前30的基因为核心基因并绘制图片。
1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 通过R 语言中RSQLitec 插件与org.He.eg.db（version3.15）数据包对基因进行编码，再运用colorspace、stringi 插件和 DOSE、clusterProfiler、pathview 数据包（version3.15），以p＜0.05 为条件进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。GO 富集分析根据值由小到大筛选每个板块排名前10 的条目，不足10 条则分析全部，p值越小，结果越显著；
KEGG 富集分析同GO 分析条件，分析排名前20 的通路。
2.1 筛选疾病差异基因 运行R 语言以|logFC|≥1 且p＜0.05 为标准，对GSE6701 芯片所载数据进行筛选，得到健康组与IBS-D 组差异基因2642 个，上调基因与下调基因分别为1033、1609 个，见图1。
图1 差异表达基因火山图
2.2 预测复方活性成分及靶点 于TCMSP 数据库中，以OB≥30%、DL≥0.18 为条件对四君子汤与痛泻要方所有成分进行筛选，得到四君子汤活性成分136 个，对应靶点229 个；
痛泻要方活性成分43 个，对应靶点129 个。
2.3 构建中药复方调控网络 运行Perl 语言进行药物靶点ID 转化，将剔重后的四君子汤与痛泻要方活性成分作用靶点基因与IBS-D 差异基因绘制Venn图，取交集。四君子汤、痛泻要方与IBS-D 交集基因分别为33、26 个，两复方作用靶点基因与IBS-D 差异基因的交集基因共36 个；
包含23 个共性基因，10个四君子汤优势交集基因；
3 个痛泻要方优势交集基因，见图2。运用Perl 语言呈现出交集基因的活性成分，运用Cytoscape 软件绘制中药复方调控网络图，得到310 条边（表示复方活性成分与疾病靶点基因之间的相互作用），144 个结点（表示四君子汤与痛泻要方活性成分和疾病靶点基因），见图3。
图2 四君子汤、痛泻要方作用靶点基因与IBS-D 差异基因Venn 图
图3 四君子汤与痛泻要方调控网络
2.4 PPI 网络分析 将2.3 所得的36 个交集基因录入STRING 数据库，构建PPI 网络。通过R 语言根据基因富集数目筛选排名前30 的基因为核心基因，绘制图片，见图4。
图4 PPI 蛋白互作网络与PPI 网络核心基因
2.5 GO 通路富集分析 运行R 语言设置p＜0.05 对痛泻要方与IBS-D 交集基因进行GO 富集分析，获得功能条目273 条，包含BP 243 条，CC 8 条，MF 22条，涉及脂多糖反应、活性氧反应、营养水平反应、质膜穴样内陷、G 蛋白偶联胺受体活性、羧酸结合、单羧酸结合等生物功能；
同法分析四君子汤与IBS-D交集靶点，获得功能条目385 条，其中BP 345 条，CC 1 条，MF 39 条，涉及调节激素水平、脂多糖反应、营养水平反应、质膜穴样内陷、G 蛋白偶联胺受体活性、羧酸结合、单羧酸结合等生物功能，见图5。其中，脂多糖反应、营养水平反应、质膜穴样内陷、G蛋白偶联胺受体活性、羧酸结合、单羧酸结合等为两复方治疗IBS-D 潜在共性生物学事件。
图5 痛泻要方及四君子汤GO 富集功能分析条形图
2.6 KEGG 通路富集分析 运行R 语言以p＜0.05 为条件对四君子汤与IBS-D 交集基因进行KEGG 富集分析，共得到功能条目64 条，涉及脂质与动脉粥样硬化、膀胱癌、化学致癌作用-受体激活、AGERAGE 等信号通路；
同法分析痛泻要方与IBS-D 交集靶点，共得到KEGG 功能条目54 条，涉及化学致癌作用-受体激活、脂质与动脉粥样硬化、类固醇激素生物合成、AGE-RAGE 等通路，见图6。涉及化学致癌作用-受体激活、脂质与动脉粥样硬化、AGERAGE 等信号通路为两复方治疗IBS-D 潜在共性调控信号通路。
图6 四君子汤与痛泻要方KEGG 富集分析气泡图
近年来，随着生活环境的改变及心理压力增加，IBS-D 在我国发病率呈上升趋势，给患者及社会医疗行业带来沉重压力[11]。中医辨证论治IBS-D独具优势，认为肝郁脾虚证、脾虚湿盛证等为IBS-D的主要证型，其中以肝郁脾虚证最为多见。四君子汤与痛泻要方是治疗IBS-D 的经典方，四君子汤始载于宋代《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、炙甘草组成，具有补中益气、健脾和胃之功，善治脾虚湿盛证[12]。痛泻要方始载于《景岳全书》，由炒白术、炒白芍、陈皮、防风组成，具有疏肝健脾、止痛止泻之功，善治肝郁脾虚证[13]。虽有大量文献对四君子汤及痛泻要方单独治疗IBS-D 的机制进行研究，但对二者“同病异治”发挥作用的共性机制鲜有报道。
本研究在网络药理学基础上筛选出四君子汤与痛泻要方活性成分及对应靶点，其中可作用于IBS-D 的靶点分别有33、26 个，共36 个，包括23 个共性靶点，这与中药复方干预疾病具有多成分、多靶点的特性相吻合[14]。同时，本研究发现四君子汤可通过脂质与动脉粥样硬化、膀胱癌、AGE-RAGE 等信号通路来调节激素水平、脂多糖反应、质膜穴样内陷、单羧酸结合等生物功能发挥治疗IBS-D 的作用；
痛泻要方可通过化学致癌作用-受体激活、类固醇激素生物合成、AGE-RAGE 等通路调节脂多糖反应、活性氧反应、营养水平反应、G 蛋白偶联胺受体活性、单羧酸结合等生物功能发挥抗IBS-D 的作用，这与中药复方多通路治病的特征一致[15]。近年来有研究发现[16，17]，IBS-D 的发病与脑肠互动失衡紊乱、免疫功能失常、内脏敏感性升高、肠道菌群失衡及肠道黏膜屏障损伤等因素密切相关，表明可从调节免疫功能、保护粘膜屏障、改变肠道运动等方面来改善IBS-D，为其临床治疗提供了新思路。有文献报道[18，19]，四君子汤可以通过改善肠道运动功能、保护肠道黏膜屏障、调节肠道菌群、干预细胞增殖及凋亡等发挥抗IBS-D 的作用，与本研究挖掘出的四君子汤抗IBS-D 主要生物学功能和通路相符。痛泻要方治疗IBS-D 涉及肠道病理生理多个方面。本研究结果显示，其治疗IBS-D 所涉及的通路中，肠道感觉功能及炎症反应发挥了主要作用，还可以适当调节精神心理。痛泻要方的有效成分可通过多通路及功能来降低内脏敏感性、改善肠道运动等。同时，IBS-D患者多表现为焦虑、抑郁，中医称之为肝气郁结，肝郁脾虚。研究发现[20]，IBS-D 肝郁脾虚者多存在脑肠互动紊乱，痛泻要方可调畅情志、条达肝气，调节脑肠肽来恢复脑肠互动、胃肠功能，降低内脏敏感性，保护肠黏膜屏障，发挥治疗IBS-D 的作用，与本研究预测出的痛泻要方治疗IBS-D 所涉及的主要生物学功能和通路相符。
综上所述，本研究基于网络药理学与GEO 数据库挖掘发现调控化学致癌作用-受体激活、脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE 等信号通路及脂多糖反应、营养水平反应、质膜穴样内陷、G 蛋白偶联胺受体活性、羧酸结合、单羧酸结合等生物功能可能为四君子汤与痛泻要方治疗IBS-D 潜在共性生物学事件。本研究尚有不足之处，未开展相关动物实验进行验证，后期需开展更多实验验证。
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