黄漫蓉，宋艳梅，范光彩，周 欢，钱成林*，夏忠悦，2
1 新希望乳业股份有限公司，四川成都 610023 2 乳品营养与功能四川省重点试验室，四川成都 610023
蛋白质是乳制品的主要营养成分之一，是衡量乳制品质量的一项重要指标[1，2]。目前检测乳制品中蛋白质的常见方法有凯氏定氮法、分光光度法、燃烧法、红外光谱法、双缩尿法、甲醛滴定法、考马斯亮蓝法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等。但是从检测结果的准确性、及时性和检测过程的安全性考虑，分光光度法和甲醛滴定法干扰物质较多，准确性差；
燃烧法不能区分蛋白氮和非蛋白氮；
红外光谱法需要定期校准，检测成分单一；
双缩尿法灵敏度差；
精密度差；
高效液相色谱-质谱联用法和毛细管电泳法所需要的检测仪器操作复杂，需要检测人员具备一定的专业技能[3～8]。
凯氏定氮法是一种比较常见的检测方法，与其他方法相比较，凯氏定氮法最适宜用来检测乳制品中蛋白质含量，检测结果准确性较高，仪器操作简单，使用者能快速掌握仪器的使用方法[9，10]。该方法主要步骤在消化和蒸馏，其中消化花费的时间最长，检测时的样品称样量也各不相同，因此本文主要对凯氏定氮法检测乳制品蛋白质含量的过程进行优化，以能更好地开展检测工作。
1.1 材料与试剂
澳特兰纯牛奶（灭菌乳）、新希望草莓味奶（调制乳）、悠质原味风味酸奶（发酵乳）、饭后半小时果蔬乳酸菌饮品（乳饮料），新希望乳业股份有限公司。
硫酸（优级纯），成都市科隆化学品有限公司；
蛋白质催化剂片（硫酸铜+硫酸钾），福斯华（北京）科技贸易有限公司；
0.05 mol/L硫酸标准溶液（SRM），深圳市博林达科技有限公司；
硼酸（分析纯），成都市科隆化学品有限公司；
氢氧化钠（分析纯），成都市科隆化学品有限公司；
溴甲酚绿（指示剂），成都市科隆化学品有限公司；
甲基红（指示剂），成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
KjeltecTM 8400全自动凯氏定氮仪、LabtecTM Line 消化炉，福斯华（北京）科贸有限公司；
电子天平（感量：0.1 mg），梅特勒-托利多仪器公司；
UPR-Ⅱ-20L 纯水机，四川优普超纯科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 试剂配制
1 g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.1 g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
1 g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1 g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
10 g/L硼酸溶液：称取10 g硼酸，加超纯水溶解并稀释至1 000 mL，加入7 mL甲基红乙醇溶液，10 mL溴甲酚绿乙醇溶液混合均匀，取30 mL配制好的硼酸溶液加100 mL纯水，颜色呈浅灰色，若偏红则用0.1 mol/LNaOH调节，若偏绿则用0.1 mol/L的HCl调节。
400 g/L氢氧化钠溶液：称取400 g固体氢氧化钠，加水溶解后放冷，并稀释至1 000 mL。
1.3.2 样品检测
称取混合均匀的一定量样品（精确至0.000 1 g）至250 mL消化管中，放入1 粒蛋白质催化剂，加入12 mL浓硫酸，混匀后于消化炉上消化，设置消化时间及消化温度，待消化结束时消化管中的液体呈绿色透明状，取出待冷却至室温，于全自动凯氏定氮仪上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程[11]。
1.3.3 蒸馏条件
使用全自动凯氏定氮仪，蒸馏条件设置为：稀释液（超纯水）70 mL、碱液（400 g/L氢氧化钠溶液）60 mL、接收液（10 g/L硼酸溶液）30 mL。
1.3.4 优化方案
（1）分别称取灭菌乳、调制乳、发酵乳、乳饮料各1 g、2 g、3 g、4 g、5 g，试样在相同条件消化蒸馏，比对不同的称样量对检测结果的影响。
（2）称取同一质量的灭菌乳、调制乳、发酵乳、乳饮料，比对不同的消化时间（40 min、60 min、80 min、100 min、150 min）对检测结果的影响。
（3）消化后的样品及时冷却一段时间后再使用凯氏定氮仪蒸馏滴定，比对不同的冷却时间（0.5 h、4 h、24 h、48 h）对检测结果的影响。
2.1 称样量优化
称取灭菌乳、发酵乳、调制乳、乳饮料不同的称样量进行平行试验，结果如表1所示，对于混合均匀的乳制品，一定范围内称样量对结果的影响不大，精密度均符合《GB 5009.5—2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》的要求，但是灭菌乳、调制乳、饮料称样量增多，精密度对应越好，发酵乳则称样量过多后精密度有所下降。
表1 灭菌乳不同称样量测定结果
2.2 消化时间优化
分别称取灭菌乳、发酵乳、调制乳、乳饮料5 g，每个样品进行4 平行试验，先在230 ℃消化30 min，后420 ℃消化。根据牛奶蛋白质检测结果综合分析，在420 ℃时消化80 min，可消化完全，精密度可以控制在1%以内。结果如表2所示。
表2 不同消化时间检测结果
2.3 冷却时间优化
分别称取灭菌乳、发酵乳、调制乳、乳饮料，每个样品进行2 平行试验，一起消化后冷却不同的时间后，再使用凯氏定氮仪进行蒸馏滴定，结果如表3所示，48 h内，检测结果没有显著差异。所以在消化结束后可以根据试验者安排，合理规划后续试验时间，不用必须接着进行蒸馏滴定操作。
表3 消化后样品冷却不同时间的蛋白质检测结果
本试验在采用国标方法的基础上使用凯氏定氮法检测牛奶中蛋白质含量，对于混合均匀的样品，不同的称样量对检测结果影响不大，样品在230 ℃消化30 min后继续在420 ℃消化80 min，能消化完全且精密度好；
消化后样品的冷却时间不影响其检测结果。