沈昕草， 朱孝仁， 刘媛媛， 吴晓阳
(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；
2. 江苏大学附属昆山医院临床实验研究中心，江苏 苏州 215300；
3. 江苏大学附属昆山医院胃肠外科，江苏 苏州 215300)
在全球恶性肿瘤中，胃癌发病率占第5位，病死率占第2位[1]。我国胃癌发病率逐年上升，已成为全球胃癌高发地区[2]。胃癌转移患者生存预后较差，无化疗的中位生存时间为3～5个月[3]。胃癌的发生和进展过程复杂，与多种基因的突变和表观遗传学改变相关[4]。
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCK)是一种多功能酶，在物种间高度保守，是调节糖异生的关键酶[5]。脊椎动物均含有两种PCK亚型，胞质型PCK1和线粒体型PCK2，二者由不同的基因编码[6]。PCK1位于染色体20q13.31，生理状态下PCK1蛋白主要位于细胞质中，激活时可转运至内质网。PCK1在糖异生、甘油异生和氨基酸合成等生物学过程中发挥重要作用[7]，其高表达易引起高血糖症和胰岛素抵抗，既往研究多探究PCK1在2型糖尿病中的发病机制与治疗方案[8-9]。近年来，Montal等[10]研究发现，PCK1在结肠源性肿瘤中呈高表达，抑制其表达可显著降低三羧酸循环活性并抑制细胞周期。但是，PCK1对胃癌细胞增殖和迁移的影响尚不清楚。本研究拟检测PCK1在胃癌细胞中的表达及其调控网络并结合相关功能学实验等，探讨PCK1在胃癌中潜在的生物学作用。
1.1 细胞系及试剂
人胃癌HGC-27、AGS细胞由中科院上海生命科学研究院细胞库提供。RPMI 1640、F-12K培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品；
敲低与过表达PCK1慢病毒和空载体购自上海吉凯基因科技有限公司(GENE)；
5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒为广州锐博生物技术有限公司产品；
Transwell细胞迁移板为美国Corning公司产品；
一抗兔抗人PCK1、一抗小鼠抗人β-肌动蛋白均为英国Abcam公司产品；
兔抗人蛋白激酶B(AKT)、p-mTOR(Ser2448)、p-Akt(Ser473)、核糖体蛋白S6(S6)、p-S6、真核翻译起始因子-4E结合蛋白1(4EBP1)、p-4EBP1均为美国Cell公司产品；
一抗β-微管蛋白、二抗均为中国ABclonal公司产品；
BCA蛋白定量试剂盒为美国Thermo Fisher公司产品。
1.2 生物信息学分析
1.2.1 基于数据库分析PCK1表达水平 在R软件(3.3.3版本，用于可视化)中利用ggplot2软件包整合TCGA数据库(http://gepia.cancer-pku/index.html)以及GTEx数据库(https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project)样本，分析PCK1在胃癌及癌旁组织中的表达水平，其中胃癌414例，癌旁组织210例。在Oncomine 4.5数据库(https://www.oncomine.org)中查找Cho Gastric Statistics数据集和TCGA Gastric Statistics数据集，Cho Gastric Statistics数据集中有19例胃癌样本和4例癌旁组织样本，TCGA Gastric Statistics数据集中有236例血液、94例胃癌和173例胃癌旁组织样本。生成PCK1转录差异表达图后，分析在胃癌及癌旁组织中PCK1mRNA表达和DNA拷贝数。在人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas，HPA)数据库(https://www.proteinatlas.org/)中在线查找胃癌样本的免疫组织化学图，通过比较该数据库中胃癌组织与癌旁组织的PCK1免疫组织化学染色，分析PCK1在胃癌中的表达水平。
1.2.2 PCK1的基因本体论富集分析 在R软件(3.6.3版本，用于统计分析与可视化)中，基于TCGA数据库的胃癌样本，以PCK1mRNA表达值的中位数为界，对低表达和高表达的差异基因进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA，https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)，以识别胃癌中差异激活的信号通路。
1.3 细胞实验
1.3.1 细胞分组及转染 取处于对数期生长期的HGC-27、AGS细胞(5×104个/孔)接种于6孔板，于37 ℃和5% CO2培养箱中培养。当汇合率达60%～70%时进行转染。将敲低PCK1的细胞分为shPCK1-Seq1组、shPCK1-Seq2组和shC组，分别转染LV-Pck1-RNAi(91486-1)慢病毒、LV-Pck1-RNAi(91488-1)慢病毒和CON313(Hu6-MCS-C8h-gcGFP-Ires-puromycin)阴性对照病毒；
将过表达PCK1的细胞分为OE-PCK1组和Vec组，分别转染LV-PFDN5(48826-1)慢病毒和CON335(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcgfp-IRES-puromycin)阴性对照病毒；
转染24 h后，加入2.5 μg/mL嘌呤霉素筛选3 d。shPCK1 Seq1的序列为CCAAGATCTTCCATGTCAA，shPCK1 Seq2的序列为TGGCCAGGATCGAAAGCAA。
1.3.2 CCK-8增殖实验检测细胞生长能力 取“1.3.1”转染后细胞(2×103个/孔)接种于96孔板，分别在培养箱中孵育24、48、72 h；
弃培养基，PBS清洗3次；
用完全培养基按1 ∶10稀释CCK-8试剂，每孔加入100 μL；
孵育1 h，测450 nm处光密度值，并绘制细胞增殖曲线。每组设5个复孔。
1.3.3 EdU细胞增殖实验检测胃癌细胞增殖能力 取“1.3.1”转染后细胞(5×104个/孔)接种于24孔板，在37 ℃和5% CO2培养箱中培养。当汇合率达70%～80%时，用完全培养基按1 ∶1 000稀释EdU溶液，每孔加入300 μL EdU染色液，于培养箱中孵育2 h；
加入Appolo染色液(按照说明书配制)避光孵育30 min；
细胞核用1×Hoechst-33342染色30 min；
于荧光显微镜(日本Olympus公司)下观察。从3个随机视野中选取至少200个细胞来计算每种细胞核内EdU阳性比率。EdU阳性比率(%)=EdU细胞数目/Hoechst细胞数目(同一视野)×100%。
1.3.4 克隆形成实验检测胃癌HGC-27、AGS细胞克隆能力 取处于对数期生长期的HGC-27、AGS细胞(1×103个/孔)接种于6孔板，在37 ℃和5% CO2培养箱中培养10～14 d，直到形成肉眼可见的细胞集落；
弃培养基，PBS洗涤2次；
4%多聚甲醛固定30 min；
PBS洗涤1次；
加入“1.3.1”转染后细胞用0.1%结晶紫染色30 min；
洗去结晶紫待晾干后，拍照并计算克隆形成数。实验重复3次。
1.3.5 Transwell实验检测胃癌HGC-27、AGS细胞迁移能力 Transwell小室放置在24孔板上，下室加入含有20%胎牛血清的600 μL F-12，上室加入约5×104个细胞重悬在无血清F-12培养基中，细胞培养箱中孵育24 h；
用2.5%结晶紫染色30 min；
在相位对比显微镜(日本Olympus公司)下随机选择3张染色细胞的显微镜图，并用软件Image J计数细胞。
1.3.6 蛋白质免疫印迹实验检测胃癌细胞中相关蛋白表达水平 取“1.3.1”转染后细胞(5×104个/孔)接种于6孔板中，在37 ℃和5%CO2培养箱中培养。当汇合率达80%～90%时，加入裂解缓冲液置于冰上裂解约30 min；
4 ℃行12 000 r/min离心15 min；
取上清液行BCA蛋白定量；
95 ℃变性8 min；
10% SDS-PAGE 80 V电泳30 min，110 V电泳直至蛋白按分子大小完全分离；
330 mA转膜120 min，将蛋白转移至PVDF膜；
10%速溶脱脂奶粉封闭2 h；
小鼠抗人β-肌动蛋白以1 ∶2 000稀释，兔抗人PCK1、p-mTOR、mTOR、p-S6、S6、p-AKT、AKT、p-4EBP1、4EBP1及β-微管蛋白均以1 ∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜；
TBST冲洗膜3次，每次10 min；
二抗以1 ∶1 000稀释，室温孵育2～4 h；
采用增强化学发光(ECL)检测系统，用Image J密度分析法定量条带灰度值。
1.4 统计学方法
2.1 PCK1在胃癌中的表达情况
基于TCGA数据库分析结果显示，PCK1mRNA在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.01,图1)。ROC曲线显示PCK1对胃癌患者预后具有良好的预测效能(图2)。Oncomine 4.5数据库分析结果显示，胃癌组织中PCK1mRNA表达水平明显高于癌旁组织，DNA拷贝数变异高于胃正常组织(P<0.05或P<0.01，图3)。HPA数据库中获得的免疫组织化学染色结果显示，PCK1蛋白表达在癌旁组织中为“+”，在胃癌组织中为“++”(图4)。
图1 胃癌与癌旁组织中PCK1 mRNA表达水平比较
A：在“Cho”数据子集中胃癌组织与癌旁组织中PCK1 mRNA表达水平比较；
B：在TCGA数据库中胃癌组织与胃癌旁组织及血液中DNA拷贝数变异比较；
*:P<0.05，与癌旁组织相比；
**:P<0.01，与胃正常组织相比
图2 胃癌患者PCK1的诊断性ROC曲线
图4 胃癌组织与癌旁组织中PCK1免疫组织化学染色结果(50×)
2.2 PCK1相关信号通路的富集分析
GSEA(条件：校正后P<0.05；
容错率<0.25)显示了MSigDB集合富集(c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt)的巨大差异。与原发性免疫缺陷、细胞黏附分子、趋化因子信号通路、全身性红斑狼疮、产生IgA的肠道免疫网络及RIGⅠ样受体信号通路相关的基因集在PCK1基因低表达表型中差异富集(图5)。
图5 PCK1基因低表达表型中差异富集的基因集
2.3 敲低PCK1抑制人胃癌HGC-27、AGS细胞增殖和迁移
蛋白质免疫印迹结果显示，与shC组比较，shPCK1-Seq1组和shPCK1-Seq2组HGC-27与AGS细胞PCK1蛋白相对表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01，图6)。CCK8实验结果显示，与shC组相比，shPCK1-Seq1组和shPCK1-Seq2组HGC-27与AGS细胞生长能力明显下降(P均<0.01，图7)。克隆形成实验结果显示，与shC组相比，shPCK1-Seq1组和shPCK1-Seq2组HGC-27与AGS细胞增殖能力明显下降(P<0.05或P<0.01，图8)。Transwell实验结果显示，与shC组相比，shPCK1-Seq1组和shPCK1-Seq2组HGC-27与AGS细胞迁移数显著下降(P均<0.01，图9)。由此表明，敲低PCK1抑制HGC-27与AGS细胞生长、增殖和迁移。
*：P<0.05，**：P<0.01，与shC组相比图6 蛋白质免疫印迹实验检测敲低PCK1后HGC-27与AGS细胞中PCK1蛋白表达水平
*:P<0.01，与shC组相比
*：P<0.05，**：P<0.01，与shC组相比
*：P<0.01，与shC组相比；
标尺示100 μm
2.4 过表达PCK1增强人胃癌HGC-27、AGS细胞增殖和迁移
蛋白质免疫印迹结果显示，与Vec组比较，OE-PCK1组HGC-27与AGS细胞中PCK1蛋白相对表达水平显著增高(P均<0.01，图10)。CCK8实验结果显示，与Vec组相比，OE-PCK1组HGC-27与AGS细胞生长能力明显增强(P均<0.01，图11)。EdU细胞增殖实验结果显示，与Vec对照组相比，OE-PCK1组HGC-27与AGS细胞增殖能力明显增强(P均<0.05，图12)。Transwell实验结果显示，与Vec对照组相比，OE-PCK1组HGC-27与AGS细胞迁移数量显著增加(P均<0.01，图13)。由此表明，过表达PCK1增强HGC-27与AGS细胞生长、增殖和迁移。
*：P<0.01，与Vec组相比
*：P<0.01，与Vec组相比
*:P<0.05，与Vec组相比
*:P<0.01，与Vec组相比；
标尺示100 μm
2.5 PCK1参与调控AKT-mTOR信号传导
shRNA敲低PCK1后，蛋白免疫印迹检测结果显示，与shC组比较，shPCK1-Seq1组和shPCK1-Seq2组p-AKT、p-mTOR、p-S6和p-4EBP1相对表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01，图14)。外源性过表达PCK1后，蛋白免疫印迹检测结果显示，与Vec组比较，OE-PCK1组p-AKT、p-mTOR、p-S6和p-4EBP1相对表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01，图15)。由此提示，PCK1在胃癌中呈高表达，并可能以激酶形式调控AKT-mTOR通路的活化，从而参与调控胃癌细胞的恶性生物学行为。
*：P<0.05，**：P<0.01，与shC组相比
*：P<0.05，**：P<0.01，与Vec组相比
本研究结果显示，PCK1蛋白在胃癌中表达上调，但其高表达的调控机制和作用机制尚不明确，故进行GSEA以识别胃癌中差异激活可能的信号通路；
结果显示，原发性免疫缺陷、细胞黏附分子、趋化因子信号通路、全身性红斑狼疮、产生IgA的肠道免疫网络及RIGⅠ样受体信号通路相关的基因集在PCK1基因低表达表型中差异富集。Ma等[11]报道，PCK1能通过糖原代谢途径调节CD8+免疫细胞形成和维持。Guo等[12]报道，孕烷X受体可能通过促进PCK1表达抑制趋化因子信号通路，进而对溃疡性结肠炎发挥保护作用。由此初步提示，PCK1可能通过免疫途径调控胃癌的进展。此外，ROC曲线显示PCK1对胃癌患者预后诊断具有良好的效能。
代谢重编程是肿瘤的典型特征之一[13]，PCK1作为糖异生的限速酶，在代谢重编程中起重要作用[14-15]。既往研究表明，在肝脏和肾脏中，PCK1表达量较高，其发挥糖异生酶的作用从而抑制肿瘤细胞生长[15-16]。有研究报道在自身PCK1表达量较低的肺和结直肠中，PCK1表达量增高可促进肿瘤细胞生长，其机制可能与葡萄糖和谷氨酰胺增多有关[10,17]。PCK1高表达可增加细胞中葡萄糖和氨基酸尤其是谷氨酰胺的合成[18]，谷氨酰胺可以衍生为谷氨酸，在蛋白质合成、转氨反应、营养物质交换等方面发挥作用，从而促进肿瘤细胞的生长[19]。本研究相关数据库结果提示，PCK1在胃正常细胞中相对表达较低，而在胃癌细胞中明显升高；
此外，体外细胞功能学实验证实，在胃癌细胞中敲低PCK1可抑制胃癌细胞生长，反之则增强。Yamaguchi等[20]研究证实，在缺氧条件下PCK1可通过对核苷酸库的维持，主要促进还原羧化作用产生嘧啶前体天冬氨酸，进而促进肿瘤细胞迁移。本研究通过Transwell实验也证实，PCK1对胃癌细胞的迁移有促进作用。由此说明，PCK1可能是促进胃癌细胞生长与迁移的一个关键基因。
此外，本研究还发现，PCK1可能通过参与诱导AKT-mTOR通路调控胃癌的恶性生物学行为。研究表明AKT-mTOR信号通路是正常生理细胞和癌细胞生长的主要调节通路之一，该通路在肿瘤中经常被激活，目前已证实与胃癌、卵巢癌和乳腺癌等多种肿瘤的发生及不良预后相关[21-24]。Montal等[10]提出PCK1促进消化道肿瘤细胞的生长与增殖，并可能与AKT-mTOR通路激活有关。PCK1可以通过谷氨酰胺的分解与α-酮戊二酸的产生激活mTOR通路[25]，提高细胞氨基酸、葡萄糖、核苷酸和脂质代谢[26]；
这些代谢途径可以为癌细胞的大分子合成提供原料[27]。本研究结果显示，敲低PCK1后胃癌细胞中AKT、mTOR以及其下游蛋白包括S6和4EBP1磷酸化水平显著降低；
反之，过表达则升高。S6以及4EBP1对蛋白质合成起重要作用，其磷酸化水平可用于评价mTOR通路的活化程度，磷酸化水平越高说明AKT-mTOR通路活性越高。由此说明，PCK1可以促进AKT-mTOR信号通路的活化。
综上所述，PCK1在胃癌中呈高表达且与患者预后相关，其高表达可促进胃癌细胞生长、增殖与迁移，这可能与PCK1调控AKT-mTOR信号通路的活化有关，但具体分子机制有待进一步研究。
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