蔡文艳,潘 悦,张琪伟,田 阳
（华东师范大学 化学与分子工程学院 上海市绿色化学与化工过程绿色化重点实验室,上海 200062）
光热疗法(photothermal therapy,PTT)是利用具有高光-热转换效率的光敏剂在目标生物组织中聚集并吸收足够的外部光能(多数为近红外光)而产生人造局部高温的效应来杀死癌细胞等病变细胞的一种新型治疗方法[1].与传统的治疗方法(如外科手术、放射疗法、化学疗法等)相比,光热疗法具有很多固有的优点.由于它的光热效应发挥取决于光敏剂和激光照射两个因素,因此,具有很好的特异性、可控性、低毒性、低侵入性以及操作便利性等特点,而且对周围的健康组织的损伤较小.此外,光热效应不依赖于氧气的存在,因此,与光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)相比,在乏氧肿瘤的治疗中具有更大的优势.
近红外光(near-infrared light,NIR Light)一般指波长介于700 nm ～3μm的光,由于其在生物组织中的散射和吸收作用较弱而具有比可见光更大的组织穿透深度[2-3],故被广泛应用于细胞、活体等生物样本的分析检测与诊疗[4-5].尤其是在光热治疗中,具有近红外吸收是对光敏剂的一个重要考察指标.目前开发的大多数光敏剂是一些具有近红外吸收的无机材料,包括一些过渡金属[6]、贵金属[7-8]以及硫化物[9-10]等的纳米颗粒.这些材料具有较长的吸收波长、良好的光-热转换(photothermal conversion,PTC)效率以及优良的光稳定性等优点,但因为生物降解困难而具有潜在的长期毒性.相对而言,有机小分子通常具有较好的生物相容性,且易于被代谢,故近年来越来越受到人们的重视.为了使有机分子的吸收波长红移至近红外,一般可以通过增加共轭链长和引入芳香基团等方法实现.基于此策略,一系列有机光热试剂被开发,例如花菁类[11-12]、并吡咯类[13-14]、卟啉类[15-16]、共轭聚合物类[17-18]等.然而,这些共轭分子通常需要繁琐耗时的有机合成过程,且分子本身的水溶性也较差,需要添加有机溶剂或者表面活性剂才能应用于水相环境.因此,如何设计开发一种便捷、有效的制备方法,获得具有良好的水溶性和较高光热转化效率的有机分子,一直是化学家们研究的热点.
本文开发了一种非常便捷、有效的制备方法,从一种吸收波长在紫外区(小于400 nm)的商业化有机小分子二苯并四硫富瓦烯(dibenzotetrathiafulvalene,DBTTF)出发,利用其与葫芦脲 [8](cucurbit[8]uril,CB[8])大环之间的主-客体包结作用[19],通过简单的一步研磨法,无须有机溶剂的参与,即可得到一种主-客体比例为1∶2的超分子三元组装体((DBTTF)2CB[8],DC).其超分子材料在水溶液中的吸收波长超过了1 000 nm,在近红外区的最大吸收波长为842 nm,是一种典型的近红外吸收材料.在880 nm激光照射下,该材料的光热转化效率达到了18.7%.我们也将此超分子光热试剂应用在了肿瘤细胞的光热消融实验中,在近红外激光照射条件下具有优异的杀灭癌细胞的作用,展现出了较好的光热治疗应用前景.
1.1 试剂与仪器
试剂:二苯并四硫富瓦烯购自Sigma-Aldrich (默克公司);葫芦脲 [8] 购于上海麦克林生化科技有限公司.所有试剂均为分析纯,直接使用,无须进一步提纯.实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm).
仪器: 紫外-可见光分光光度计UH5300和荧光光谱仪F-4500 (日本Hitachi); 核磁共振波谱仪600 MHz和高分辨质谱仪6800(德国Bruker).LWIRL808-5W-F激光器购于北京镭志威光电技术有限公司;FLIR-E4红外热成像仪购于深圳市粤通仪表有限公司.TCS-SP8激光共聚焦显微镜购置于莱卡公司.
1.2 超分子有机光热试剂的制备
将DBTTF(6.84 mg,0.022 mmol)、CB[8](15 mg,0.011 mmol)同 时 加 入 石 英 研 钵 中,研 磨5 min至固体混合均匀,然后向研钵内滴加2滴蒸馏水,继续研磨5 min至蒸馏水完全挥发.在研磨期间,固体由黄色变为绿色,最后变为蓝黑色粉末状固体.
DC的核磁共振氢谱及质谱表征结果.1H NMR(500 MHz,D2O)d7.68(s,8H),7.37(s,8H),5.69(d,J=15.3 Hz,16H),5.49(s,16H),4.15(s,16H).LC-MS:C76H64N32O16S8,[(DBTTF)2+CB[8]]2+/2,calcd.968.146 6,found:968.147 6.
1.3 光热实验
用移液枪量取50μL不同浓度的DC溶液至1 mL比色皿中,使用880 nm的近红外激光在不同功率密度下照射DC溶液升温至稳定平台,关闭近红外激光使溶液自然冷却.在此过程中使用红外成像测温仪实时记录溶液的温度变化,并按照如下公式计算光热转换效率[20]:
式(1)中:h表示传热系数,A表示传热面积,hA可参照式(2)计算;Tmax表示最高稳态温度,TSurr是环境温度;QDis表示被溶剂和石英样品池吸收的光的散热,可由式(4)计算得到;I是入射激光功率;A880是溶液在880 nm波长处的吸光度.
式(2)中:mD和cD分别表示纯溶剂(水)的质量和热容;τS可以参照式(3)来计算.
式(3)中:t表示时间;τS表示样品体系的时间常数;TRT表示冷却期中的实时温度.
式(4)中:Tmax(water)为照射水得到的最高温度;τS(water)为根据式(3)得到的水的时间常数.
1.4 细胞培养
HeLa细胞购于中国科学院上海生命科学研究院.细胞在含有10%胎牛血清的DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培养液中培养,温度为37℃,二氧化碳浓度为5%.
将HeLa细胞与DC的PBS(phosphate buffered saline)溶液(30μmol/L)在培养 皿 中 共 培 养12 h,用新鲜的培养基多次清洗至多余的DC溶液至完全洗净,然后用880 nm的激光(0.6 W/cm2)照射5 min.接着用钙黄绿素/碘化丙啶对细胞进行染色. 荧光图像由激光共聚焦显微镜拍摄.
2.1 超分子自组装体的结构表征
如图1(a)所示,按照上述实验步骤中的说明,将黄色的DBTTF粉末与白色的CB[8]粉末在微量水分存在下研磨后,可以明显观察到固体颜色变深,最后变成蓝黑色,表明研磨过程中物质化合物可能发生了一种化学反应.将该蓝黑色粉末溶于水后,可得到蓝色溶液,这与研磨前的两种物质形成鲜明的对比.研磨前,DBTTF完全不溶于水,而CB[8]的水溶液则是无色透明液体.为了理解这一水溶性与颜色的变化机理,本文对DC的水溶液进行了吸收光谱的测试.如图1(b)所示,两个原料(DBTTF与CB[8])的吸收波长都在紫外区,而DC的水溶液则在402 nm、596 nm、842 nm 3处产生了明显的吸收峰.根据文献报道,这是四硫富瓦烯类化合物典型的自由基阳离子二聚体状态的吸收[21].该体系中自由基阳离子的产生,是由于研磨过程中空气中的氧气与DBTTF接触并氧化造成,而自由基阳离子之所以能稳定存在,是由于两分子的DBTTF之间的π-π堆积以及分子间电荷转移作用的存在[22],同时CB[8]大环空腔也提供了一个屏蔽的疏水空腔.因此,DBTTF的自由基阳离子可以在CB[8]空腔中配对堆叠并稳定存在,形成了一种三元自组装体(DBTTF)2CB[8],简记为DC,如图2(a).
图1 DC的制备过程及其各组分的吸收光谱Fig.1 Preparation of DC and absorption spectra of DBTTF,CB[8],and DC
为了证明上述三元自组装结构的存在,我们对DC在氘代水溶剂中进行了核磁共振氢谱的表征.如图2(b)所示,1H NMR中的各种质子的积分面积表明,DBTTF和CB[8]之间的计量比为2∶1(水溶液中有部分自由状态的CB[8]残留,根据核磁积分结果,自组装效率约为80%).为了进一步理解DBTTF与CB[8]之间的主-客体相互作用,开展了二维ROESY核磁的研究,如图2(c)所示,可以明显观察到属于DBTTF的b氢与属于CB[8]大环的x氢之间具有nuclear Overhauser effects(NOE)信号[23-24],这表明这两种氢在空间上具有相关性,而x氢是指向CB[8]大环分子空腔内部的.因此,根据一维和二维核磁的结果,可以证明DBTTF与CB[8]之间是以2∶1的计量比形成了一种主-客体包结产物.此外,在正模式下,DC的高分辨质谱图谱中可以观察到968.147 6的质荷比,归属于[(DBTTF)2+CB[8]]2+/2的离子峰(图2(d)),而且同位素峰值均相差0.5 D(道尔顿)左右,说明组装体DC含有两个单位正电荷,符合自由基阳离子二聚体的特征.这一结果与理论模拟质谱图的同位素峰吻合(图2(e)).
图2 超分子组装体DC的自组装机理示意图及结构表征Fig.2 Schematic of the self-assembly mechanism and structural characterization of DC
2.2 超分子组装体的水溶液光热性能测试
由于DC溶液在近红外区有较强的吸收,我们进一步探究了它的光热转换性能.如图3(a)所示,在0.9 W/cm2,880 nm的激光照射300 s后,DC水溶液的温度从29.5℃上升到88.2℃,共升高58.7℃;对照组蒸馏水用相同功率密度的激光照射相同时间后,温度仅上升了4.5℃.计算后得到DC水溶液的光热转换效率为18.7%,这表明该材料有着较好的光热转换能力.随后测试了不同浓度和不同激光功率密度下DC水溶液的升温曲线.从图3(b)和3(c)可见,DC水溶液的温度随着浓度和激光功率密度的升高而升高,表明DC水溶液有着较好的浓度依赖性和功率依赖性.最后还测试了其3个升温冷却周期的温度曲线图.由图3(d)可见,DC溶液的光热转换表现出良好的重复性,表明其在本实验光照条件下有着良好的光稳定性和热稳定性.
图3 DC的光热性能测试Fig.3 Photothermal measurements of DC
2.3 超分子光热试剂在活细胞中的光热治疗性能验证
在上述实验的基础上进一步探究DC是否具有在活细胞中进行光热治疗的性能.本文选择HeLa细胞作为模型,在与DC孵育后用0.6 W/cm2,880 nm激光照射5 min,并用钙黄绿素和碘化丙啶染色来检测光热消融的效果.如图4所示,共聚焦荧光成像结果显示,没有光照下的DC组以及没有DC孵育的激光组都没有明显的死亡细胞,表明单纯的DC和本实验光照条件本身并不能对细胞造成伤害,而DC+Laser组可以发现HeLa细胞基本上都已死亡.由上述实验可知:DC在没有辐射的情况下表现出较低的细胞毒性和较好的生物相容性;在光照激发下,可以迅速升温杀死HeLa细胞,因此DC有着较好的光热治疗潜力.
图4 细胞光热实验的共聚焦荧光成像图Fig.4 Confocal fluorescence images from photothermal ablation experiments on HeLa cells
本文提出了一种非常简单有效的有机超分子光热材料的制备方法,基于DBTTF与CB[8]之间的超分子自组装策略,通过简单的一步研磨法可以得到一种具有近红外吸收的三元超分子组装体.该超分子中CB[8]大环稳定了DBTTF的自由基阳离子对,其水溶液的吸收波长在近红外处有一个较强的吸收峰(842 nm),且最长吸收波长超过了1 000 nm.在880 nm激光照射下,该材料具有良好的光热转化性能、光热稳定性和生物相容性,其光热转化率达到了18.7%.因此,在光热治疗、光热转化等领域具有潜在的应用价值.
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