华加敏,田雨,何生平,刘小军,向明慧,周天赐,徐晨杰,陈芳慧,蔡亚非*
(1.南京农业大学动物科技学院/江苏省奶牛生产性能测定中心/奶牛疾病诊断联合创新实验室,江苏 南京 210095;2.南京卫岗乳业有限公司,江苏 南京 211100;3.青海省海南州科技局,青海 海南藏族自治州 813000)
奶牛围产期一般是指产前15 d到产后15 d,在此期间奶牛分别经历了妊娠、分娩以及泌乳三个阶段,而以分娩为界,围产期奶牛大多在产后发生各种疾病[1]。奶牛分娩后泌乳需求快速增加,而此时奶牛干物质的摄入不足以支撑其消耗,进入能量负平衡状态,从而引起机体碳水化合物和脂肪代谢失调,最终导致奶牛酮病发生[2]。有研究表明,患有酮病的奶牛常表现出生产性能及血液相关指标的变化,如奶牛血、尿、乳液中的酮体含量升高,血糖浓度降低,产奶量下降,以及奶牛消化代谢能力下降[3]。
奶牛酮病是一种严重的代谢性疾病,它不仅给奶牛的健康造成危害,严重影响奶牛的生产性能及繁殖性能,还会对奶业的生产造成巨大的经济损失。所以,如何在奶牛患酮病之前发出预警信息,及时发现奶牛酮病易感个体,及时诊断酮病的发生并及时治疗处理是降低酮病危害,减轻酮病造成经济损失的有效途径及研究重点。有基于血液指标的研究表明,奶牛临产前1～2周的血清β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA)和游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)可以作为奶牛酮病的预警指标[4],产后14～21 d酮病奶牛会出现血Ca和血Mg浓度下降,肝功能指标天门冬氨酸转移酶(aspartate acid transferase,AST)和总胆红素(total bilirubin,TBIL)升高[5];也有基于奶牛生产性能测定(又称奶牛群体改良dairy herd improvement,DHI)数据研究证明,牛乳乳糖、乳脂率和脂蛋比可以对奶牛酮病进行早期预警[6]。但单一指标监测存在较大误差,多指标相结合更利于提供可靠信息帮助牧场得出准确判断;且同一指标对奶牛酮病的预警值因地域、品种差异及饲养管理条件差异而存在差异[7]。
DHI是奶牛饲养管理和育种的关键技术,也是奶牛繁殖疾病诊断的重要手段;此外,血液学研究在疾病病理研究中也具有重要作用。目前江苏省境内研究奶牛产后鲜牛乳及血细胞分析对预测奶牛患酮病风险的报道较少。因此,本试验通过对江苏省境内某规模化牧场高产成母牛进行连续3年追踪发现,该牛群奶牛产后前3个月易表现出酮病症状,连续3年采集该奶牛群体产后3个月内的生产性能数据,筛选分群获得25头健康和20头酮病奶牛,并采集2020年产后第1个月奶牛的外周血液样本,进一步探究生产性能指标及外周血血细胞指标与酮病发生之间的关系,以及其对奶牛产后发生酮病风险的预警作用。
1.1 试验动物
试验牛为2018—2020年连续3年追踪的江苏省境内某牧业有限公司的规模化饲养高产成母牛。母牛采用常规饲养管理,自由采食全混合日粮(total mixed ration,TMR)和饮水。全混合日粮的主要组成及营养成分见表1所示:
表1 全混合日粮组成及营养成分Table 1 The composition and nutrient of total mixed ration(TMR)
1.2 监测指标
1.2.1 奶牛DHI测定由奶牛场专业工作人员科学规范采样:采用三次法挤奶,按照早晨、中午、晚上为4∶3∶3的比例收集奶样;每次每头奶牛采集35～50 mL牛奶至装有防腐剂的采样瓶中,确保采样瓶中防腐剂完全溶解并与奶样混合均匀后保存于低温环境。采样当天寄送至江苏省DHI中心及时检测。接收奶样后,水浴锅40 ℃加热使其恢复到初产奶时的温度,利用乳成分分析仪(丹麦,FossomaticTMMilkoScan FT+)及体细胞分析仪(丹麦,FossomaticTMFC)进行测定,检测牛奶中的BHBA、体细胞数(somatic cell number,SCC)、乳糖、乳脂、乳蛋白、日产奶等指标。以奶牛产后30 d内生鲜奶中BHBA≥0.2 mmol·L-1为判定标准[8],将奶牛分为健康组和酮病组。所选泌乳早期奶牛排除其他疾病,选择酮病奶牛20头,健康奶牛25头,共45头,试验期间由牧场统一饲养管理。
1.2.2 奶牛血液指标的检测对试验所选奶牛群体,于清晨空腹时进行尾静脉采集全血,使用EDTA-K2真空采血管收集。采集的外周血血液样品用全自动血液分析仪(Mindray,BC-5000 Vet)测定血细胞成分指标。包括白细胞参数:白细胞数(white blood cell count,WBC)、淋巴细胞数(lymphocyte count,LYM)、中性粒细胞数(neutrophil count,NEU)、嗜酸性粒细胞数(eosinophil count,EOS);红细胞参数:红细胞数(red blood cell count,RBC)、血红蛋白含量(hemoglobin content,HGB)、平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin content,MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)、红细胞压积(hematocrit,HCT)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume,MCV)、红细胞分布宽度变异系数(red blood cell distribution width-coefficient of variation,RDW-CV)和红细胞分布宽度标准差(red blood cell distribution width-standard deviation,RDW-SD);血小板参数:血小板数(platelet count,PLT)、血小板分布宽度(platelet distribution width,PDW)、平均血小板体积(mean platelet volume,MPV)。
1.3 数据统计与分析
2.1 奶牛DHI指标的变化
试验所选牛群在2018年时90%以上奶牛为2胎生产,所以2019年牛群多为3胎次牛,2020年牛群多为4胎次牛。正常组和酮病组奶牛生产性能指标的变化如图1所示。通过对所选牛群连续3年的追踪发现,牛奶中的体细胞数(SCC)在酮病组与正常组中无显著差异,其体细胞数为(10～25)×104mL-1,处于正常水平,表明所选奶牛群体乳房健康,无被感染情况。分析奶牛产奶量变化发现正常组与酮病组奶牛连续3年的产后3个月的日产奶量均无显著差异(P>0.05)且都维持平稳高产状态,日泌乳量达40 kg左右。说明本次试验所选牛群是经过不断优化选育的遗传稳定高产牛群。
生鲜奶中β-羟丁酸(BHBA)的含量在每年产后的第2个月和第3个月均低于酮病的判定标准(≥0.2 mmol·L-1),但与正常组相比仍增加显著,正常组的BHBA含量一直维持在0.1 mmol·L-1左右。酮病组奶牛在2018—2019年产后第1个月乳糖率显著下降(P<0.05),说明产后第1个月机体代谢反应最为激烈,机体虚弱的同时供应高产奶量,乳糖供应不足导致机体状态无法恢复而导致酮病;而2020年产后第1个月乳糖的含量维持正常水平,但是BHBA的含量仍然达到了0.24 mmol·L-1,推断该试验所选牛群由于长期反复的酮病刺激,已经进入易感状态,外界饲养管理措施无法有效改变奶牛易患酮病的风险。
生鲜奶中的乳脂率和乳蛋白率指标是评价奶品质的重要指标,脂蛋比是乳脂率与乳蛋白率之比。如图1所示,连续3年酮病组奶牛乳脂率在产后第1个月显著升高(P<0.05),产后第2个月整体水平升高但未达到统计学差异,产后第3个月恢复到正常水平。而整体上2组奶牛乳蛋白率维持相对稳定,脂蛋比的变化趋势则与乳脂率一致,连续3年每年奶牛产后的第1个月酮病组显著上升,第2个月整体水平升高但统计学差异不显著,第3个月恢复到正常水平。表明产后第1个月处于能量负平衡状态的奶牛发生脂肪动员,使循环中的游离脂肪酸和酮体过度升高,部分游离脂肪酸进入乳汁中导致乳脂合成增加,乳脂率上升,脂蛋比增高。由此可见,乳脂率和脂蛋比对预测奶牛患酮病风险具有一定指示作用。
图1 正常组和酮病组奶牛生产性能指标的变化Fig.1 Dairy herd improvement(DHI)indexes of health and ketosis cows 1)数字1、2、3分别代表每一年产后第1、2、3月的数据。The number 1,2 and 3 represent the data of the first,second and third month after postpartum every year. 2)*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。下同。The same as follows.
2.2 奶牛外周血血细胞分析
红细胞参数的变化结果表明:与正常组奶牛相比,酮病组奶牛的RBC、HGB和HCT均极显著下降(P<0.001),MCV显著下降(P<0.05),说明与正常组相比,酮病组奶牛处于相对贫血状态。其他指数如MCH、MCHC、RDW-CV和RDW-SD的平均值统计差异均不显著(表2)。
表2 正常组和酮病组奶牛血液中红细胞参数Table 2 Red blood cell parameters of health and ketosis cows
白细胞参数分析结果表明:酮病组奶牛的LYM差异极显著(P<0.001),EOS增加显著(P<0.05);NEU和WBC平均细胞数差异不显著,但白细胞数整体水平上略有升高。血小板参数分析结果表明:正常组与酮病组奶牛的PLT、MPV和PDW均维持相对一致,未出现显著差异(表3)。
表3 正常组和酮病组奶牛血液中白细胞和血小板参数Table 3 White blood cell and platelet parameters of health and ketosis cows
2.3 酮病与各指标相关性分析
2.3.1 与奶牛生产性能指标变化的相关性分析皮尔逊相关分析结果(表4)显示:牛乳中的乳脂率、总固体与酮病呈显著正相关,乳糖与酮病呈显著负相关,胎次P值为0.051,即将达到显著相关性,故也纳入回归模型中。运用二元Logistic回归分析,将乳脂率、乳糖、总固体及胎次作为自变量,以是否发生酮病作为因变量,筛选出对酮病具有预测性的指标。二元Logistic回归分析结果(表5)显示:乳脂率(P<0.01)和总固体(P<0.05)是与酮病显著相关的指标,说明乳脂率与总固体作为生产性能指标,可以作为奶牛酮病的预警指标。
表4 奶牛生产性能指标与酮病的相关性分析Table 4 Correlation analysis between DHI indexes and ketosis
表5 方程中的变量Table 5 Variables in the equation
2.3.2 奶牛外周血血细胞指标变化的相关性分析由皮尔逊相关分析(表6和表7)可知:在各白细胞、红细胞、血小板参数中,RBC、HGB、MCV、HCT、LYM和EOS差异显著(P<0.05),其余指标均无显著差异(P>0.05)。建立2个二元Logistic回归分析模型,其中模型Ⅰ包含红细胞参数:RBC、HGB、HCT和MCV,分析结果表明各红细胞参数无显著性差异;模型Ⅱ包含白细胞参数:LYM、EOS,从表8分析结果得到:只有淋巴细胞数P值小于0.05,其余均大于0.05为不相关变量,说明淋巴细胞数作为外周血血细胞指标,可以对酮病起到一定的预警。
表6 红细胞参数与酮病的相关性分析Table 6 Correlation analysis between red blood cell parameters and ketosis
表7 白细胞和血小板参数与酮病的相关性分析Table 7 Correlation analysis between white blood cell and platelet parameters and ketosis
图2 酮病奶牛乳脂率、总固体与淋巴细胞数的 受试者工作特征(ROC)曲线Fig.2 Receiver operating characteristic(ROC)curve of milk fat rate,total solids and lymphocytes in ketosis cow
表8 方程中的变量Table 8 Variables in the equation
2.3.3 乳脂率和淋巴细胞数对酮病的预警性分析进一步对乳脂率、总固体和淋巴细胞数 3个指标进行ROC分析,结果如图2和表9所示,其中乳脂率和淋巴细胞数的P值均小于0.05,表明二者均具有良好的风险评估效果。计算Youden指数,即横坐标特异性与纵坐标敏感性差异最大的点所对应的阈值,得出乳脂率的最佳分界值为4.21%,淋巴细胞数的最佳分界值为4.815×109·L-1。
表9 酮病奶牛乳脂率、总固体与淋巴细胞数的分界值及参数Table 9 Boundary value and parameter of milk fat rate,total solids and lymphocytes in ketosis cow
近年来随着奶牛养殖集约化、规模化、精细化管理的提高,奶牛的生产性能也逐步提升,同时,奶牛患酮病的风险也在逐年增加[9]。有研究表明,我国奶牛的酮病发病率为15%～30%,多见于3～5胎的高产奶牛[10]。建立酮病的早期诊断方法及防治措施,监测奶牛的群体健康状况,预测、预警奶牛疾病的发生,是防止奶牛发生疾病的有效手段。
奶牛群体改良(DHI)测定技术是以监测奶牛生产性能指标为主,现已在全国范围内推广,不仅是企业科学化养殖的标志,也可以有效预警奶牛酮病的发生[11]。根据生产性能分析结果,与正常组相比,酮病组生鲜奶中β-羟丁酸(BHBA)含量连续3年在产后的3个月显著升高,表明奶牛泌乳早期易感酮病;且在产后第1个月达到最大值,随后2个月显著性逐月降低,表明奶牛酮病患病率逐月下降,这与van der Drift等[12]研究结果一致。国际上公认的判定奶牛酮病标准是血浆BHBA含量≥1.2 mmol·L-1[2],本研究基于江苏省DHI中心平台每月对牧场进行长期的追踪,根据奶牛产后30 d内出现临床酮病事件(生鲜乳中BHBA含量≥0.2 mmol·L-1)来诊断是否患有酮病[8,13]。因患病牛乳中BHBA含量与血中BHBA具有较高的正相关性,且具有代表性好、采样方便、奶牛无应激等优点[2],因此通过乳酮浓度监测可以直观反映机体酮体状况,作为奶牛酮病的一个关键早期预警指标,监控奶牛泌乳早期的健康状况[14]。国外也多采用临床症状诊断结合乳酮检测来判断酮病[15]。
奶牛体细胞数(SCC)是反映奶牛乳房健康与否的重要标志,正常情况下体细胞数一般为(20～30)×104mL-1[16],牧场常根据体细胞数指标对奶牛乳腺炎进行预警[11]。本试验中正常组与酮病组奶牛体细胞数均处于正常值范围内,说明奶牛乳房无感染、损伤或病变等情况,排除了试验所选奶牛群体乳腺炎影响酮病预警预指标的筛选。
张彬等[17]研究了亚临床酮病对奶牛产奶性能的影响,发现患病牛与正常组奶牛产奶量差异不大;刘琴等[13]通过DHI酮病模块对云南4家参测牧场的DHI数据分析得出,奶牛产后10～60 d多发生酮病,且日产奶量越高,奶牛患酮病风险越高。本试验牛群均来自于江苏省境内规模化某牧场,采用相同的饲养管理以及采食相同的TMR,由日产奶量数据可以看出,本试验牛群均为稳定高产奶牛,连续3年奶牛日产奶量均在40 kg左右,奶牛品系遗传性能较为优良,故本试验中酮病预警指标的筛选是在排除遗传背景差异,选取高度选育过的高产中国荷斯坦奶牛的前提下进行的。
乳糖、乳脂肪、乳蛋白是牛乳中的重要营养成分[18]。酮病奶牛泌乳早期由于能量负平衡,生糖物质摄入不足,血糖下降,从而使乳糖合成减少,再加上机体脂肪动员,生成大量游离脂肪酸和甘油[19],部分游离脂肪酸进入乳汁使得乳脂率上升。脂蛋比是乳脂率与乳蛋白率之比,本试验中乳糖、乳脂率和脂蛋比在产后第1个月均表现出显著差异,故乳糖、乳脂率及脂蛋比均可作为奶牛酮病的一个早期诊断指标,这与何开兵[6]的研究结果一致;赵秀新等[16]也提出,荷斯坦奶牛的正常脂蛋比一般为1.12～1.36,泌乳早期较高的脂蛋比可以反映出奶牛是否进入能量负平衡。
乳蛋白对奶牛发挥免疫功能具有重要意义[20],而免疫功能的发挥依赖于免疫细胞的数量及类型[21]。Meijer等[22]研究指出,乳蛋白对巨噬细胞和淋巴细胞的增殖具有重要作用。此外有研究表明,能量负平衡会造成奶牛免疫抑制和炎症反应[23-25]。本试验中淋巴细胞和嗜酸性粒细胞数在酮病组显著上升,白细胞数虽然统计学差异不显著,但在酮病组整体呈上升趋势,说明泌乳早期酮病奶牛外周血免疫细胞数增加,推测是由于机体较高的应激敏感性或较强的炎症反应引起的白细胞数增多[26]。从奶牛的遗传差异角度解释,由于该试验牛群均为高产奶牛,其遗传性能优良,试验中并未都表现出免疫抑制现象[27-28];其乳蛋白率又连续3年保持稳定,对机体的免疫细胞具有一定增殖作用,使得奶牛外周血中白细胞数上升。
外周血红细胞参数分析结果显示,酮病组奶牛红细胞数、血红蛋白含量、红细胞压积下降极显著,平均红细胞体积下降显著,推断血液中红细胞数生成减少、血红蛋白含量降低造成了奶牛贫血[29],贫血进一步降低了红细胞压积(HCT),HCT是指示血液稀释程度和血液黏稠度的重要指标;红细胞平均体积(MCV)则是指细胞因为贫血而发生的形态变化。血液作为机体循环系统的重要组成部分[30],红细胞及血红蛋白又担任着给机体运输氧气养分、排出代谢废物的重要职责,奶牛泌乳早期贫血对自身的代谢造成了严重影响,加剧了奶牛对体内碳水化合物及游离脂肪酸的代谢障碍,从而引发酮症。
进一步从生产性能以及血液血细胞指标与酮病的相关性分析及ROC曲线分析发现,在本试验所选取的江苏省境内某规模化牧场奶牛群中,生产性能指标乳脂率可作为奶牛患酮病风险的预警指标,因为奶牛酮病与机体脂肪动员息息相关,而脂肪动员会影响奶牛乳脂的合成,其预警分界值为4.21%。血液血细胞指标淋巴细胞数也是与酮病显著相关的指标,淋巴细胞作为免疫细胞的重要成员,它在机体内数量的多少在一定程度上体现了奶牛机体的免疫功能以及奶牛对酮病的易感性,其预警分界值为4.815×109L-1。
综上所述,本研究通过对江苏省境内同一牧场高产成母牛泌乳早期生产性能及血液血细胞指标进行统计分析,结果表明该规模化牧场奶牛酮病与乳脂率和淋巴细胞数目指标有显著关系,建议把乳脂率大于4.21%以及淋巴细胞数大于4.815×109L-1作为该牛场酮病的联合预警指标。通过对奶牛泌乳早期定期进行DHI测定和外周血全血分析监测相关指标的变化,可以追踪奶牛泌乳早期的生理健康状态,及时预警酮病,从而做出相应的饲养和管理调整,实现对奶牛群的精细化管理,降低奶牛生产成本,提高奶牛的生产效益。
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