胡文娴，路昊明，张媛媛，沐 远
(1.滇西应用技术大学 云南省高校洱海流域生态环境质量检测工程研究中心，洱海研究院，云南 大理 671006；
2.安徽大学 文典学院，安徽 合肥 230601；
3.北京动物园 圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京 100044；
4.大理大学 东喜玛拉雅研究院，云南 大理 671003)
由于生存环境、生活史对策和进化程度等因素的影响，鱼类的视觉能力与陆生哺乳动物有明显差异[1-2].对水环境的适应使鱼类的眼睛形成了一系列特殊的结构，鱼类的晶状体是圆球形的，远方物体反射的光线通过晶状体折射形成的影像，落在了视网膜的前方，所以鱼类看不清远方的物体.此外，由于受水中微生物、悬浮物以及水层的影响，光线投射会受到阻碍，不像在空气中可以看得很远.因此，鱼眼的构造适于看近物[3].
角膜是眼睛最外层的组织，对动物的视觉至关重要，具有折射光线以及保护眼睛内部结构的功能[4-5].不同于视锥细胞和视杆细胞，角膜由于其独特的结构和生理功能，在不同的环境中，可能具有不同的适应机制[4].此外，角膜内部结构有不同的细胞类型和细胞密度，以及微绒毛(microvilli)、微褶(microplicae)、微嵴(microridges)、微孔(microholes)等微结构[6].研究发现，由于对不同方位的视觉感知(例如：上、下、前、后等)，同一眼球不同区域的角膜上皮细胞数量、形态、微结构等会出现差异[7].背眼虾虎鱼亚科是具有两栖特性的类群，常活动于潮间带、滩涂等生境中[8].背眼虾虎鱼亚科中，在一个昼夜循环的部分时间里完全陆栖的类群被称为弹涂鱼(mudskipper)，包括大弹涂鱼属(Boleophthalmus)、青弹涂鱼属(Scartelaos)、齿弹涂鱼属(Periophthalmodon)和弹涂鱼属(Periophthalmus)[9].在背眼虾虎鱼亚科中，可以看到一个由低到高的陆生性排序.弹涂鱼的陆生性高于亚科内其他属，弹涂鱼内部，青弹涂鱼属陆生性最低，而弹涂鱼属陆生性最高.Hu等[10]发现，由于生境和发育时序上的差异，背眼虾虎鱼亚科鱼类角膜上皮细胞结构出现了差异，并在不同区域上也有了差别；
进一步发现，其角膜发育相关基因COL8A2在该类群中也出现了特异性演化特征[11].
斑叉牙虾虎鱼(Apocryptodonpunctatus)隶属于虾虎鱼目(Gobiiformes)虾虎鱼科(Gobiidae)背眼虾虎鱼亚科(Oxudercinae)叉牙虾虎鱼属(Apocryptodon).叉牙虾虎鱼属鉴别特征为：第4椎骨侧突具向后延伸的小片(lamina)，并具眶上孔.斑叉牙虾虎鱼活体形态特征主要为：背部浅绿色，腹部白色；
侧线连续，体侧具5～6个黑斑，并有一黑色线条自眼下方贯穿尾柄;鱼鳍透明，第2背鳍具小黑斑;尾鳍基部灰色，下部黑色，上部淡橘色;臀鳍后方浅黑色;腹鳍端部淡橘色;胸鳍基部橘色，下部边缘淡灰色;背鳍前鳞片22～23枚[9].
斑叉牙虾虎鱼的基础生态学特征为：其为日本群岛南部特有种，模式标本采集于九州岛.主要栖息于河口附近无植物区，温带开放性泥滩[12-13].根据Dotsu，Koyama等[12-13]观察发现，该种一般活跃于淤泥沉积较多的内湾区，常与甲壳类动物双凹鼓虾(Alpheusbisincisus)等共栖，或栖息于蟹类及另一虾虎鱼目物种——红狼牙虾虎鱼(Odontamblyopusrubicundus)的洞穴中.胃容物研究发现，该种在仔稚鱼阶段以浮游动物为食，成年后转向植食性，主要摄食淤泥表面的硅藻.该种与背眼虾虎鱼亚科其他种类，如大弹涂鱼属共同利用硅藻资源，但能通过错开觅食时间的方式减少竞争.具体方法为叉牙虾虎鱼属在涨潮后游出藏身处摄食，而大弹涂鱼属在退潮后滩涂暴露于空气中时爬行摄食.日本有明海种群繁殖期约为5—7月，雌鱼怀卵量592～5 826枚，卵黏性，椭圆形，长约1 mm，一端具黏丝.仔鱼营水层浮游生活，成体转向底栖，约2 a时间达到性成熟[12].在背眼虾虎鱼亚科中，该物种相对于其他大多数类群，更偏向水生的环境.就目前而言，关于该物种视觉适应的研究仍然不多.
1.1 样本及基本情况
叉牙虾虎鱼样本(成体)来自中国科学院动物研究所(ASIZB)鱼类标本馆，其基本情况如表1所示.
表1 该研究所用样本基本信息
1.2 样品处理、数据测量和分析
在ZEISS STEISV II体视显微镜下观察眼睛形状、位置，沿鱼眼缘完整取出标本右侧眼球.用蒸馏水将切下的眼球洗净，以80%至100%酒精梯度脱水.利用LEICAEMCPP 300型临界点干燥仪进行干燥，HITACHIE-1010 SPUTTER型离子溅射仪喷镀，利用HITACHI S-3000N型扫描电镜观察样品并拍照.以鱼眼自然睁开状态下暴露的角膜，分别取正中、上、下、左、右5个区域进行观察比较.为确保照片的有效性，每个区域均选择多个位置拍摄5张以上的照片记录信息，拍摄位点见图1所示.
图1 角膜观察点位示意图
由于扫描电镜下，鱼类的角膜被放大许多倍(笔者所用图片放大范围为8 000～28 000倍)，扫描电镜所记录图片中有比例尺大小和原图的边长尺寸，可计算得出图片的实际面积.关于细胞计数统计方法，采用类似于细胞计数板法，每1张图片相当于细胞板中间的计数格，由于图片中细胞边界明显，计数时统计图片内出现的所有细胞，对于图片边缘出现不完整的细胞，仅计算左侧和上侧的细胞(包括压线细胞)，省略图片下侧和右侧的压线细胞，以此方法来减小计数误差.利用ARCGIS10软件打点统计每1张图片中的细胞数量，测量图片尺寸，根据图片比例尺计算各个图片的角膜上皮细胞的密度，再通过多张图片的数据取平均值得出每1个标本每1个区域的角膜密度.
观察所拍摄的电镜图片，确定图片中的细胞类型及微结构类型，同样利用ARCGIS10软件测量微嵴的宽度以及微嵴间距，根据图片比例尺换算所测得的距离长度，再通过多个点位和多张图片的数据取平均值得出每1个标本每1个区域的微嵴宽度和微嵴间距值.
利用SPSS 22.0计算上皮细胞的密度、微嵴宽度和微嵴间距的总体平均值(结果用Mean表示)，并做相关分析.
2.1 细胞形态结构观察
斑叉牙虾虎鱼(A.punctatus)的角膜上皮细胞如图2所示，细胞边界明显，具有微嵴(microridge)，且微嵴清晰连续，微嵴和微嵴间隙的宽度可测量，但未观察到微孔(microholes)、微褶(microplicae)和微绒毛(microvilli).细胞类型为微嵴型细胞.
图2 斑叉牙虾虎鱼角膜上皮细胞电镜扫描结构(mr：微嵴)(以上图片仅为参与统计的部分图片，主要为展示结构)
2.2 角膜上皮细胞密度、微嵴宽度和微嵴间距
斑叉牙虾虎鱼(A.punctatus)角膜不同区域上皮细胞密度，最大值出现在右侧，为19 782 mm-2，角膜细胞密度整体平均值为(18 106±1 719)mm-2.角膜不同区域上皮细胞的微嵴宽度，最大值出现在下侧，为252 nm，角膜细胞的微嵴宽度平均值为(240±9)nm.角膜上皮细胞的微嵴间距宽度，最大值出现在左侧，为297 nm，角膜细胞的微嵴间距宽度平均值为(251±34)nm.如表2所列.
表2 斑叉牙虾虎鱼角膜不同区域上皮细胞的密度、微嵴宽度和微嵴间距
2.3 角膜上皮细胞密度与微嵴宽度呈显著负相关
为了探究角膜上皮细胞密度与微嵴宽度之间的关系，进行相关分析.结果发现，角膜上皮细胞密度与微嵴宽度之间具有显著的负相关，公式为：Log10(Microridge width)=3.78-0.33Log10(Cell density)(R2=0.82，p<0.01)，即随着细胞密度的增加，微嵴宽度减小，如图3所示.角膜上皮细胞密度与微嵴间距之间无显著相关关系(p>0.05).
图3 角膜上皮细胞密度和微嵴间距平均值的相关性
角膜上皮细胞中，不同的微结构特征具有与之相对应的功能.研究发现，微绒毛(microvilli)的主要功能是使得细胞的表面积增加，从而有助于吸收氧气和其他营养物质进入细胞，此外，还能够协助水分的运输和营养物质的代谢，它对于陆生脊椎动物，在空气中保持泪膜的固有形态和清晰的视觉方面非常重要；
微嵴(microridges)对于增加细胞膜表面积是效率最低的一种微结构，它通常出现在高渗透压环境(主要是海洋)；
微褶(microplicae)起到支持细胞形态与增加角膜表层渗透交换的作用；
微孔(microholes)的挤压使黏液得以分泌到角膜表面[14-15].笔者在斑叉牙虾虎鱼的角膜上皮细胞中，只观察到了微嵴1种微结构，这种微结构很可能与该物种基本只在海水中活动，其角膜应对海水渗透压有关.一般来说，海洋物种中微嵴型细胞最为常见[17].笔者的研究中，斑叉牙虾虎鱼(A.punctatus)栖息于缺少植物区的河口地带、温带泥滩的开放性区域及海水中[16]，角膜上皮细胞为微嵴型细胞，与水生的布氏棘鲷(Acanthopagrusbutcheri)相似[14].这在一定程度上说明，在背眼虾虎鱼亚科中，该物种由于对水环境的依赖程度较大，角膜上皮细胞仍保留了适应水生环境的特征.
“四眼鱼(Anablepsanableps)”每只眼睛都能同时看到水线的上方(空气环境)和下方(水环境)，使其可以在水面或浅滩觅食“保持警惕”，以防止捕食者可能从水面上或水面下接近，以及搜寻来自水面上方的小昆虫作为食物[18-19].对其角膜不同位置细胞密度和微结构的差异研究发现，不同区域的角膜具有形态学上的适应性[7].细胞密度随角膜渗透压的降低而降低，角膜的微嵴宽度差异表明，可能有一些功能性的作用[14, 17, 20].斑叉牙虾虎鱼(A.punctatus)的眼球基本在眼眶内，笔者的研究结果发现，其上、下、左、右、中不同区域间的角膜上皮细胞密度、微嵴间距和微嵴宽度出现了一些差异，一定程度上提示斑叉牙虾虎鱼的角膜与四眼鱼类似，可能也产生了一些适应性的改变.但由于样本的匮乏，因此需要后期研究中进一步验证.此外，笔者还发现细胞密度和微嵴间距之间具有显著的负相关关系，这与其他不同物种间呈现的趋势一致，即细胞密度和微嵴间距之间可能具有相互制约的关系.
脊椎动物由水生过渡到陆生的进化飞跃，一直以来备受科学界的关注.目前为科学界公认的是，泥盆纪时期的四足形类肉鳍鱼，是陆生脊椎动物的共同祖先[15].然而现生肉鳍鱼类多样性较低，仅存6个淡水物种及2个海洋物种，且特化程度高，与泥盆纪时期的四足形类肉鳍鱼相比已发生较大改变[21].而背眼虾虎鱼亚科物种，尤其是4个两栖性最高的“弹涂鱼”属，在印度-西太平洋地区的沿海红树林滩涂中达到最高多样性[9]，是现代辐鳍鱼类向陆地生境进化的活样本.弹涂鱼在解剖结构、生态习性[22]方面与泥盆纪四足形类肉鳍鱼有可比之处，可以对研究脊椎动物由水生过渡到陆生的进化过程提供参考.
在硬组织方面，弹涂鱼与四足形类的潘氏鱼具有相似之处[23]，但泥盆纪四足形类早已灭绝，包括眼球、角膜在内的软组织结构完全没有留存.笔者的研究证明习性偏水生的斑叉牙虾虎鱼晶状体更接近球形，微结构仅有1种微嵴，与纯水生鱼类更为接近；
这些研究结果与先前对4个弹涂鱼属角膜微结构的研究[10]一起，构建了更多的从水生到两栖、从简单到复杂的角膜微结构进化序列，为两栖鱼类的视觉进化提供了更清晰的线索，以期为探索脊椎动物从水到陆、“从鱼到人”的进化命题提供新的启发.