何君强, 熊雯宇, 黄 莹, 刘 斌,2
(1.福建农林大学食品科学学院；
2.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002)
糖尿病和手足口病发病率高，已成为重大公共卫生问题，给患者健康和社会经济带来沉重负担.肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属的一种嗜神经性病毒，也是婴幼儿手足口病的主要病原体[1].目前，关于高效抗EV71感染药物的研究多处于基础试验阶段.市面上用于治疗糖尿病的药物虽然可以有效控制血糖水平，但对患者肠道功能的副作用不容忽视.食药用菌是一类珍贵的佳肴与药材，除了含有丰富的矿物质、氨基酸和维生素等营养物质外，还富含多种具有降血糖、血脂，增强机体免疫，抗病毒和肿瘤等药理作用的活性物质[2].蔡超等[3]研究结果显示皱盖假芝和枣翘鳞肉齿菌的水提物对HSV-1、EV71-CSFI4和EV71-PTPS病毒均具有较好的抑制效果.张雪松等[4]发现羊肚菌、桑黄、灵芝、蝉花、虫草水提取物对4种糖苷酶均有不同程度的抑制作用.灰树花(Grifolafrondosa)隶属多孔菌科树花菌属，是一种大型药食两用真菌[5]，含有多种生物活性物质，如可抑制EV71复制的新型多糖GFP1[6]和具有降血糖作用的多糖GFP-W[7].目前关于灰树花其他活性成分的相关研究较少.Chen et al[8]仅发现灰树花醇提物中的吡咯生物碱对α-葡萄糖苷酶表现出抑制作用.
本研究拟以70%乙醇作为提取溶剂，按照极性从低到高依次萃取，得到不同极性萃取物，研究各萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71的抑制作用；
同时利用超高效液相色谱质谱联用(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS)和分子对接技术，分析萃取物中发挥活性作用的潜在活性物质及其相互作用模式，以期发现灰树花中具有降血糖和抗病毒作用的活性物质，为以灰树花作为功能性食品进行开发和利用提供依据.
1.1 供试材料
灰树花子实体购于浙江省龙泉市建松土特产经营部，经福建农林大学国家菌草工程技术研究中心鉴定；
人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)由中国科学院上海细胞库提供；
EV71由南京大学提供；
无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司；
磷酸盐缓冲液、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(PNPG)、甲醇、乙腈(色谱纯)购于上海麦克林生化科技有限公司；
CCK-8试剂盒购于北京兰博利德生物技术有限公司；
DMEM高糖液体培养基、血清、青霉素、链霉素、胰酶购于Biosharp公司.
1.2 仪器与设备
DHG-9240A电热恒温干燥箱由上海一恒科技有限公司提供；
HH-3A数显三用水浴锅由金坛市精达仪器制造厂提供；
KH20R-Ⅱ高速离心机由湖南凯达科学仪器有限公司提供；
MCO-5M型三气培养箱由日本PHCbi公司提供；
FD-3冷冻干燥机由上海五久自动化设备有限公司提供；
MK3型酶标仪、Vanquish液相色谱仪、QE-HF-X质谱仪均由美国Thermo公司提供.
1.3 方法
1.3.1 灰树花醇提物不同极性萃取物的制备 取灰树花子实体烘干，经粉碎机粉碎至粗粉，以70%乙醇作为溶剂，在50 ℃下超声提取2次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩得到灰树花70%乙醇提取物.将70%乙醇提取物用适量蒸馏水充分溶解后，采用液液萃取法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至有机层无色，合并各萃取液，浓缩干燥得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物.
1.3.2α-葡萄糖苷酶抑制率的测定 参照文献[9]，并稍作修改.利用磷酸盐缓冲液(0.1 mmol·L-1，pH=6.8)配制1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 μg·mL-1的萃取物.取30 μL样品置于孔板中，加入30 μLα-葡萄糖苷酶(0.2 U·mL-1)于37 ℃下静置10 min；
加入30 μL的底物P-NPG (5 mmol·L-1)，37 ℃下孵育15 min；
加入90 μL Na2CO3溶液(0.1 mol·L-1)终止反应，测定光密度(D405 nm).以相同浓度的阿卡波糖作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液替代样品作为对照组，用磷酸盐缓冲液替代α-葡萄糖苷酶作为背景组.计算公式表示如下：
式中：D1为试验组的D405 nm；
D2为试验背景组的D405 nm；
D3为对照组的D405 nm；
D4为对照背景组的D405 nm.
1.3.3 物质毒性的测定 取处于对数生长期的RD细胞，用胰蛋白酶消化2 min后用10% DMEM培养基制成每孔含有5 000个细胞的细胞悬液，铺入孔板中，置于培养箱中培养(37 ℃,5%CO2).待细胞生长至60%～70%时，弃去上清液，加入800、400、200、100、50、25 μg·mL-1萃取物，在2%DMEM培养基中继续培养，每个浓度设置6个重复，同时设置阴性对照组和不加细胞的空白组.培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h后测定D450 nm.计算细胞活力：
式中：D0为不加细胞和不加样品的D450 nm；
D1为加细胞和样品的D450 nm；
D2为加细胞和不加样品的D450 nm.
1.3.4 抗EV71活性测定 取RD细胞悬液铺于孔板中培养24 h，然后每孔加入10 μL的EV71病毒溶液；
继续培养2 h后，加入400、200、100、50、25 μg·mL-1萃取物与利巴韦林，每个浓度设置6个重复.同时设置模型组、阴性对照组和阳性对照组.24 h后，利用CCK-8试剂盒测定D450 nm.计算病毒抑制率：
式中：D0为加病毒、不加样品的D450 nm；
D1为加病毒和样品的D450 nm；
D2为不加病毒和样品的D450 nm.
1.3.5 化学成分分析 色谱条件：ACQUITY UPLC®HSS T3(1.8 μm，2.1 mm×150 mm)，流速0.25 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量2 μL.流动相(负离子模式)：5 mmol·L-1甲酸铵水(A)+乙腈溶液(B).流动相(正离子模式)：0.1%甲酸水(C)+0.1%甲酸乙腈(D).洗脱程序：0～1 min，2%B/D；
1～9 min，2%～50%B/D；
9～12 min，50%～98%B/D；
12.5～13.5 min，98%B/D；
13.5～14.5 min，2%～98%B/D.
质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正负离子电离模式，以分辨率70 000进行全扫描，其中毛细管温度为325 ℃，碰撞电压为30 eV.
1.3.6 蛋白靶点分子对接 化合物结构式来自PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，之后导入Chem3D软件，利用MM2模块进行优化以及能量最小化，保存为sdf格式文件,作为分子对接的配体分子.利用RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)寻找a-glucosidase与EV71病毒衣壳蛋白VP1[6]的结构，之后利用Schrödinger软件包对蛋白进行能量最小化,以及几何结构的优化.在Autodock中导入化合物与蛋白分子，根据蛋白结构的预测信息确定其结合位点，盒子大小设置为20 Å×20 Å×20 Å，格点距离为0.375 Å.最后通过标准精度对接方法进行分子对接及筛选.将对接后化合物与蛋白形成的复合物利用Pymol 2.1软件进行可视化，得到化合物与蛋白的结合模式.
1.4 数据处理
试验重复3次，结果以平均值±标准差表示.采用GraphPad Prism 7.0等软件对数据进行处理、分析和绘图.
2.1 灰树花醇提物不同极性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
α-葡萄糖苷酶参与将淀粉分解为葡萄糖的过程，导致血糖水平升高.因此，α-葡萄糖苷酶是2型糖尿病治疗的重要靶点.α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅能延缓葡萄糖的水解和吸收，有效控制餐后血糖水平，还能保护胰岛细胞，缓解糖尿病并发症[10].由图1可知，62.5～1 000.0 μg·mL-1萃取物对α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，对α-葡萄糖苷酶的抑制率随着萃取物浓度的增大而增大，呈现一定的量效关系.1 000 μg·mL-1正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到95%以上(抑制作用显著).通过计算IC50可知不同含量萃取物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力由大到小依次为：(174.12±10.67) μg·mL-1正丁醇萃取物>(216.41±13.21) μg·mL-1阿卡波糖>(322.49±7.31) μg·mL-1石油醚萃取物>(378.74±20.01) μg·mL-1水溶物>(596.55±18.14) μg·mL-1乙酸乙酯萃取物.结果显示正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果强于其他萃取物及阿卡波糖.黄余燕等[11]研究结果也表明正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用，但是萃取物中发挥作用的活性成分还有待进一步研究.
2.2 灰树花醇提物不同极性萃取物对RD细胞增殖能力的影响
由图2可知，当各萃取物浓度低于400 μg·mL-1时，各萃取物作用后的细胞活力与正常模型组相比无显著差异(P>0.05)，表明在此浓度范围内RD细胞能正常生长.与正常组相比，800 μg·mL-1石油醚萃取物和水溶物作用后的细胞活力存在明显差异(P<0.05).为了不影响样品抗病毒效果的评估，选取25～400 μg·mL-1萃取物进行抗EV71活性研究.
*表示与阳性对照组(阿卡波糖)相比差异显著(P<0.05).图1 灰树花醇提物不同极性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of different solvent extracts from G. frondosa ethanal extract on α-glucosidase
*表示与正常组相比差异显著(P<0.05).图2 灰树花醇提物不同极性溶剂萃取物对RD细胞的的毒性作用Fig.2 Toxic effect of different solvent extracts from G. frondosa ethanal extract on RD cells
2.3 灰树花醇提物不同极性萃取物的抗EV71活性
EV71属于小RNA病毒科A型肠道病毒属，感染后可能引起神经系统症状或心肌炎性心脏病等并发症，接种疫苗是预防EV71感染的有效方法[12].为降低利巴韦林的毒副作用，选择100 μg·mL-1利巴韦林作为阳性对照[13].由图3可知，各萃取物对EV71的抑制作用与质量浓度呈正比，当质量浓度低于50 μg·mL-1时，各萃取物对EV71的抑制率低于50%.石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物对EV71的抑制作用较弱，当质量浓度为400 μg·mL-1时，抑制率为50%左右.100 μg·mL-1正丁醇萃取物的抑制率达55%以上，200 μg·mL-1正丁醇萃取物对EV71的抑制作用显著高于利巴韦林(P<0.05).400 μg·mL-1水溶物的抗病毒效果明显强于利巴韦林(P<0.05).通过计算IC50可知，不同极性萃取物对EV71的抑制能力由大到小依次为：(84.41±5.12) μg·mL-1正丁醇萃取物>(121.56±12.35) μg·mL-1水溶物>(289.48±14.41) μg·mL-1石油醚萃取物>(393.37±30.93) μg·mL-1乙酸乙酯萃取物.水溶物的抗病毒作用可能源于含有的多糖成分[6]，而正丁醇萃取物的抗EV71效果强于水溶物，但是发挥作用的活性成分尚不明确.
2.4 正丁醇萃取物的化学成分分析
与其他萃取物相比，正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71的抑制效果较好.通过峰面积列出正丁醇萃取物中相对含量较高的10个化合物，表1显示正丁醇萃取物主要含有氨基酸、甾醇、酯类和核苷类物质，其中，含量最高的4-氨基丁酸是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，具有改善机体睡眠质量的生理功效[14]，L-色氨酸常用作食品强化剂、抗氧剂[15].研究[16]表明氨基酸能促进胰高血糖素的分泌，从而使血糖水平升高.植物鞘氨醇和麦角甾醇对肿瘤细胞活性具有显著的抑制作用，但是Chen et al[8]发现麦角甾醇及其衍生物不是灰树花发挥降血糖作用的相关成分.5-甲基硫代腺苷能诱导结肠癌细胞凋亡[17]，尿苷具有促进心肌细胞代谢，加速蛋白质、核酸的生物合成和能量产生等作用[18].糖醇和酚类化合物能够为机体清除自由基[19]，庚二酸常被用作生物素合成的前体[20].
*表示与阳性对照组(利巴韦林)相比差异显著(P<0.05).图3 灰树花醇提物不同极性溶剂萃取物对EV71的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of different solvents extracts from G. frondosa ethanal extract on EV71
表1 正丁醇萃取物的UPLC-MS分析Table 1 UPLC-MS analysis of n-butanol extract
周丽琬等[21]发现薏苡仁中的顺式-亚油酸甲酯对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用；
Su et al[22]的试验结果显示灰树花正己烷提取物中的亚油酸可能是其发挥α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性物质.此外，广泛存在于自然界中的酯类化合物对人体健康也有积极的作用[23-24].
2.5 分子对接
通过分子对接研究亚油酸甲酯、α-葡萄糖苷酶和VP1蛋白之间的结合活性与结合模式.分子对接结果显示亚油酸甲酯与α-葡萄糖苷酶的得分为-28.82 kJ·mol-1，而VP1的得分为-26.36 kJ·mol-1.一般认为得分值<-20.92 kJ·mol-1则表示化合物与靶点之间有较好的结合活性[25]，表明亚油酸甲酯、α-葡萄糖苷酶和VP1之间均存在良好的结合活性.
根据结合模式可以看到亚油酸甲酯与α-葡萄糖苷酶相结合的氨基酸残基(图4).亚油酸甲酯可与ASN-258形成氢键，且氢键较短(平均长度为2.6 Å)，远小于传统氢键的长度(3.5 Å)，结合能力强.另外，该化合物具有很强的疏水性，能够与PHE-282、 PRO-223、PHE-225、ILE-143、PHE-144、TYR-388、MET-385、PHE-163、ALA-200氨基酸形成π-π共轭相互作用，对稳定小分子有重要作用.
A.3D结合模式图;B.2D结合模式图;C.详细结合模式图.图4 亚油酸甲酯与α-葡萄糖苷酶的结合模式图Fig.4 Binding mode of methyl linoleate with α-glucosidase
如图5所示，亚油酸甲酯结合在VP1蛋白口袋深处，与VP1蛋白存在氢键及疏水的相互作用.亚油酸甲酯通过氢键与ASN-228、CYS-225氨基酸结合，并与MET-230、MET-229、PRO-226、ALA-224、ALA-275、ILE-113、ILE-111、PHE-204、TRP-203氨基酸存在很强的疏水作用，可有效促使亚油酸甲酯与VP1蛋白形成稳定的复合物，从而阻止病毒进入细胞.
综上，亚油酸甲酯、α-葡萄糖苷酶和EV71的靶点蛋白在对接打分以及结合模式方面均存在较好表现，与蛋白关联性较强.表明亚油酸甲酯具有与α-葡萄糖苷酶和EV71结合的能力，从而发挥α-葡萄糖苷酶竞争抑制和阻止病毒入侵细胞的作用.
本研究比较了灰树花醇提物不同极性溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71的抑制作用，结果显示正丁醇萃取物对EV71的抑制作用较强；
同时对α-葡萄糖苷酶的抑制效果强于阿卡波糖.UPLC-MS与分子对接结果表明亚油酸甲酯在正丁醇萃取物中的含量较高，且可利用α-葡萄糖苷酶与EV71表面活性位点相结合而发挥活性作用.本研究发现灰树花正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71病毒具有较强的抑制作用，亚油酸甲酯可作为治疗糖尿病和手足口病的潜在活性成分.
A.3D结合模式图;B.2D结合模式图;C.详细结合模式图.图5 亚油酸甲酯与VP1蛋白的结合模式图Fig.5 Binding mode of methyl linoleate with VP1 protein
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