灰树花醇提物对α-葡萄糖苷酶和EV71的抑制作用及其活性成分分析

时间:2023-08-18 12:25:02 来源:网友投稿

何君强, 熊雯宇, 黄 莹, 刘 斌,2

(1.福建农林大学食品科学学院;
2.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心,福建 福州 350002)

糖尿病和手足口病发病率高,已成为重大公共卫生问题,给患者健康和社会经济带来沉重负担.肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属的一种嗜神经性病毒,也是婴幼儿手足口病的主要病原体[1].目前,关于高效抗EV71感染药物的研究多处于基础试验阶段.市面上用于治疗糖尿病的药物虽然可以有效控制血糖水平,但对患者肠道功能的副作用不容忽视.食药用菌是一类珍贵的佳肴与药材,除了含有丰富的矿物质、氨基酸和维生素等营养物质外,还富含多种具有降血糖、血脂,增强机体免疫,抗病毒和肿瘤等药理作用的活性物质[2].蔡超等[3]研究结果显示皱盖假芝和枣翘鳞肉齿菌的水提物对HSV-1、EV71-CSFI4和EV71-PTPS病毒均具有较好的抑制效果.张雪松等[4]发现羊肚菌、桑黄、灵芝、蝉花、虫草水提取物对4种糖苷酶均有不同程度的抑制作用.灰树花(Grifolafrondosa)隶属多孔菌科树花菌属,是一种大型药食两用真菌[5],含有多种生物活性物质,如可抑制EV71复制的新型多糖GFP1[6]和具有降血糖作用的多糖GFP-W[7].目前关于灰树花其他活性成分的相关研究较少.Chen et al[8]仅发现灰树花醇提物中的吡咯生物碱对α-葡萄糖苷酶表现出抑制作用.

本研究拟以70%乙醇作为提取溶剂,按照极性从低到高依次萃取,得到不同极性萃取物,研究各萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71的抑制作用;
同时利用超高效液相色谱质谱联用(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS)和分子对接技术,分析萃取物中发挥活性作用的潜在活性物质及其相互作用模式,以期发现灰树花中具有降血糖和抗病毒作用的活性物质,为以灰树花作为功能性食品进行开发和利用提供依据.

1.1 供试材料

灰树花子实体购于浙江省龙泉市建松土特产经营部,经福建农林大学国家菌草工程技术研究中心鉴定;
人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)由中国科学院上海细胞库提供;
EV71由南京大学提供;
无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司;
磷酸盐缓冲液、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(PNPG)、甲醇、乙腈(色谱纯)购于上海麦克林生化科技有限公司;
CCK-8试剂盒购于北京兰博利德生物技术有限公司;
DMEM高糖液体培养基、血清、青霉素、链霉素、胰酶购于Biosharp公司.

1.2 仪器与设备

DHG-9240A电热恒温干燥箱由上海一恒科技有限公司提供;
HH-3A数显三用水浴锅由金坛市精达仪器制造厂提供;
KH20R-Ⅱ高速离心机由湖南凯达科学仪器有限公司提供;
MCO-5M型三气培养箱由日本PHCbi公司提供;
FD-3冷冻干燥机由上海五久自动化设备有限公司提供;
MK3型酶标仪、Vanquish液相色谱仪、QE-HF-X质谱仪均由美国Thermo公司提供.

1.3 方法

1.3.1 灰树花醇提物不同极性萃取物的制备 取灰树花子实体烘干,经粉碎机粉碎至粗粉,以70%乙醇作为溶剂,在50 ℃下超声提取2次,每次1 h,合并提取液,减压浓缩得到灰树花70%乙醇提取物.将70%乙醇提取物用适量蒸馏水充分溶解后,采用液液萃取法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至有机层无色,合并各萃取液,浓缩干燥得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物.

1.3.2α-葡萄糖苷酶抑制率的测定 参照文献[9],并稍作修改.利用磷酸盐缓冲液(0.1 mmol·L-1,pH=6.8)配制1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 μg·mL-1的萃取物.取30 μL样品置于孔板中,加入30 μLα-葡萄糖苷酶(0.2 U·mL-1)于37 ℃下静置10 min;
加入30 μL的底物P-NPG (5 mmol·L-1),37 ℃下孵育15 min;
加入90 μL Na2CO3溶液(0.1 mol·L-1)终止反应,测定光密度(D405 nm).以相同浓度的阿卡波糖作为阳性对照,用磷酸盐缓冲液替代样品作为对照组,用磷酸盐缓冲液替代α-葡萄糖苷酶作为背景组.计算公式表示如下:

式中:D1为试验组的D405 nm;
D2为试验背景组的D405 nm;
D3为对照组的D405 nm;
D4为对照背景组的D405 nm.

1.3.3 物质毒性的测定 取处于对数生长期的RD细胞,用胰蛋白酶消化2 min后用10% DMEM培养基制成每孔含有5 000个细胞的细胞悬液,铺入孔板中,置于培养箱中培养(37 ℃,5%CO2).待细胞生长至60%~70%时,弃去上清液,加入800、400、200、100、50、25 μg·mL-1萃取物,在2%DMEM培养基中继续培养,每个浓度设置6个重复,同时设置阴性对照组和不加细胞的空白组.培养48 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续培养2 h后测定D450 nm.计算细胞活力:

式中:D0为不加细胞和不加样品的D450 nm;
D1为加细胞和样品的D450 nm;
D2为加细胞和不加样品的D450 nm.

1.3.4 抗EV71活性测定 取RD细胞悬液铺于孔板中培养24 h,然后每孔加入10 μL的EV71病毒溶液;
继续培养2 h后,加入400、200、100、50、25 μg·mL-1萃取物与利巴韦林,每个浓度设置6个重复.同时设置模型组、阴性对照组和阳性对照组.24 h后,利用CCK-8试剂盒测定D450 nm.计算病毒抑制率:

式中:D0为加病毒、不加样品的D450 nm;
D1为加病毒和样品的D450 nm;
D2为不加病毒和样品的D450 nm.

1.3.5 化学成分分析 色谱条件:ACQUITY UPLC®HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×150 mm),流速0.25 mL·min-1,柱温40 ℃,进样量2 μL.流动相(负离子模式):5 mmol·L-1甲酸铵水(A)+乙腈溶液(B).流动相(正离子模式):0.1%甲酸水(C)+0.1%甲酸乙腈(D).洗脱程序:0~1 min,2%B/D;
1~9 min,2%~50%B/D;
9~12 min,50%~98%B/D;
12.5~13.5 min,98%B/D;
13.5~14.5 min,2%~98%B/D.

质谱条件:采用电喷雾离子源(ESI),正负离子电离模式,以分辨率70 000进行全扫描,其中毛细管温度为325 ℃,碰撞电压为30 eV.

1.3.6 蛋白靶点分子对接 化合物结构式来自PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),之后导入Chem3D软件,利用MM2模块进行优化以及能量最小化,保存为sdf格式文件,作为分子对接的配体分子.利用RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)寻找a-glucosidase与EV71病毒衣壳蛋白VP1[6]的结构,之后利用Schrödinger软件包对蛋白进行能量最小化,以及几何结构的优化.在Autodock中导入化合物与蛋白分子,根据蛋白结构的预测信息确定其结合位点,盒子大小设置为20 Å×20 Å×20 Å,格点距离为0.375 Å.最后通过标准精度对接方法进行分子对接及筛选.将对接后化合物与蛋白形成的复合物利用Pymol 2.1软件进行可视化,得到化合物与蛋白的结合模式.

1.4 数据处理

试验重复3次,结果以平均值±标准差表示.采用GraphPad Prism 7.0等软件对数据进行处理、分析和绘图.

2.1 灰树花醇提物不同极性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶参与将淀粉分解为葡萄糖的过程,导致血糖水平升高.因此,α-葡萄糖苷酶是2型糖尿病治疗的重要靶点.α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅能延缓葡萄糖的水解和吸收,有效控制餐后血糖水平,还能保护胰岛细胞,缓解糖尿病并发症[10].由图1可知,62.5~1 000.0 μg·mL-1萃取物对α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用,对α-葡萄糖苷酶的抑制率随着萃取物浓度的增大而增大,呈现一定的量效关系.1 000 μg·mL-1正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到95%以上(抑制作用显著).通过计算IC50可知不同含量萃取物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力由大到小依次为:(174.12±10.67) μg·mL-1正丁醇萃取物>(216.41±13.21) μg·mL-1阿卡波糖>(322.49±7.31) μg·mL-1石油醚萃取物>(378.74±20.01) μg·mL-1水溶物>(596.55±18.14) μg·mL-1乙酸乙酯萃取物.结果显示正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果强于其他萃取物及阿卡波糖.黄余燕等[11]研究结果也表明正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用,但是萃取物中发挥作用的活性成分还有待进一步研究.

2.2 灰树花醇提物不同极性萃取物对RD细胞增殖能力的影响

由图2可知,当各萃取物浓度低于400 μg·mL-1时,各萃取物作用后的细胞活力与正常模型组相比无显著差异(P>0.05),表明在此浓度范围内RD细胞能正常生长.与正常组相比,800 μg·mL-1石油醚萃取物和水溶物作用后的细胞活力存在明显差异(P<0.05).为了不影响样品抗病毒效果的评估,选取25~400 μg·mL-1萃取物进行抗EV71活性研究.

*表示与阳性对照组(阿卡波糖)相比差异显著(P<0.05).图1 灰树花醇提物不同极性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of different solvent extracts from G. frondosa ethanal extract on α-glucosidase

*表示与正常组相比差异显著(P<0.05).图2 灰树花醇提物不同极性溶剂萃取物对RD细胞的的毒性作用Fig.2 Toxic effect of different solvent extracts from G. frondosa ethanal extract on RD cells

2.3 灰树花醇提物不同极性萃取物的抗EV71活性

EV71属于小RNA病毒科A型肠道病毒属,感染后可能引起神经系统症状或心肌炎性心脏病等并发症,接种疫苗是预防EV71感染的有效方法[12].为降低利巴韦林的毒副作用,选择100 μg·mL-1利巴韦林作为阳性对照[13].由图3可知,各萃取物对EV71的抑制作用与质量浓度呈正比,当质量浓度低于50 μg·mL-1时,各萃取物对EV71的抑制率低于50%.石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物对EV71的抑制作用较弱,当质量浓度为400 μg·mL-1时,抑制率为50%左右.100 μg·mL-1正丁醇萃取物的抑制率达55%以上,200 μg·mL-1正丁醇萃取物对EV71的抑制作用显著高于利巴韦林(P<0.05).400 μg·mL-1水溶物的抗病毒效果明显强于利巴韦林(P<0.05).通过计算IC50可知,不同极性萃取物对EV71的抑制能力由大到小依次为:(84.41±5.12) μg·mL-1正丁醇萃取物>(121.56±12.35) μg·mL-1水溶物>(289.48±14.41) μg·mL-1石油醚萃取物>(393.37±30.93) μg·mL-1乙酸乙酯萃取物.水溶物的抗病毒作用可能源于含有的多糖成分[6],而正丁醇萃取物的抗EV71效果强于水溶物,但是发挥作用的活性成分尚不明确.

2.4 正丁醇萃取物的化学成分分析

与其他萃取物相比,正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71的抑制效果较好.通过峰面积列出正丁醇萃取物中相对含量较高的10个化合物,表1显示正丁醇萃取物主要含有氨基酸、甾醇、酯类和核苷类物质,其中,含量最高的4-氨基丁酸是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质,具有改善机体睡眠质量的生理功效[14],L-色氨酸常用作食品强化剂、抗氧剂[15].研究[16]表明氨基酸能促进胰高血糖素的分泌,从而使血糖水平升高.植物鞘氨醇和麦角甾醇对肿瘤细胞活性具有显著的抑制作用,但是Chen et al[8]发现麦角甾醇及其衍生物不是灰树花发挥降血糖作用的相关成分.5-甲基硫代腺苷能诱导结肠癌细胞凋亡[17],尿苷具有促进心肌细胞代谢,加速蛋白质、核酸的生物合成和能量产生等作用[18].糖醇和酚类化合物能够为机体清除自由基[19],庚二酸常被用作生物素合成的前体[20].

*表示与阳性对照组(利巴韦林)相比差异显著(P<0.05).图3 灰树花醇提物不同极性溶剂萃取物对EV71的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of different solvents extracts from G. frondosa ethanal extract on EV71

表1 正丁醇萃取物的UPLC-MS分析Table 1 UPLC-MS analysis of n-butanol extract

周丽琬等[21]发现薏苡仁中的顺式-亚油酸甲酯对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用;
Su et al[22]的试验结果显示灰树花正己烷提取物中的亚油酸可能是其发挥α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性物质.此外,广泛存在于自然界中的酯类化合物对人体健康也有积极的作用[23-24].

2.5 分子对接

通过分子对接研究亚油酸甲酯、α-葡萄糖苷酶和VP1蛋白之间的结合活性与结合模式.分子对接结果显示亚油酸甲酯与α-葡萄糖苷酶的得分为-28.82 kJ·mol-1,而VP1的得分为-26.36 kJ·mol-1.一般认为得分值<-20.92 kJ·mol-1则表示化合物与靶点之间有较好的结合活性[25],表明亚油酸甲酯、α-葡萄糖苷酶和VP1之间均存在良好的结合活性.

根据结合模式可以看到亚油酸甲酯与α-葡萄糖苷酶相结合的氨基酸残基(图4).亚油酸甲酯可与ASN-258形成氢键,且氢键较短(平均长度为2.6 Å),远小于传统氢键的长度(3.5 Å),结合能力强.另外,该化合物具有很强的疏水性,能够与PHE-282、 PRO-223、PHE-225、ILE-143、PHE-144、TYR-388、MET-385、PHE-163、ALA-200氨基酸形成π-π共轭相互作用,对稳定小分子有重要作用.

A.3D结合模式图;B.2D结合模式图;C.详细结合模式图.图4 亚油酸甲酯与α-葡萄糖苷酶的结合模式图Fig.4 Binding mode of methyl linoleate with α-glucosidase

如图5所示,亚油酸甲酯结合在VP1蛋白口袋深处,与VP1蛋白存在氢键及疏水的相互作用.亚油酸甲酯通过氢键与ASN-228、CYS-225氨基酸结合,并与MET-230、MET-229、PRO-226、ALA-224、ALA-275、ILE-113、ILE-111、PHE-204、TRP-203氨基酸存在很强的疏水作用,可有效促使亚油酸甲酯与VP1蛋白形成稳定的复合物,从而阻止病毒进入细胞.

综上,亚油酸甲酯、α-葡萄糖苷酶和EV71的靶点蛋白在对接打分以及结合模式方面均存在较好表现,与蛋白关联性较强.表明亚油酸甲酯具有与α-葡萄糖苷酶和EV71结合的能力,从而发挥α-葡萄糖苷酶竞争抑制和阻止病毒入侵细胞的作用.

本研究比较了灰树花醇提物不同极性溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71的抑制作用,结果显示正丁醇萃取物对EV71的抑制作用较强;
同时对α-葡萄糖苷酶的抑制效果强于阿卡波糖.UPLC-MS与分子对接结果表明亚油酸甲酯在正丁醇萃取物中的含量较高,且可利用α-葡萄糖苷酶与EV71表面活性位点相结合而发挥活性作用.本研究发现灰树花正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶和EV71病毒具有较强的抑制作用,亚油酸甲酯可作为治疗糖尿病和手足口病的潜在活性成分.

A.3D结合模式图;B.2D结合模式图;C.详细结合模式图.图5 亚油酸甲酯与VP1蛋白的结合模式图Fig.5 Binding mode of methyl linoleate with VP1 protein

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