费嵩禹，王梓懿，荆晓凤，杨 帆，陈晓艺，李宪臻
（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）
β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21），又称β-葡萄糖苷水解酶，是一种用于改善食品风味或生产活性单体成分的重要酶制剂，广泛应用于食品、药品、保健品等领域[1]。近年来，有关β-葡萄糖苷酶在食品加工领域的应用备受关注，有研究表明，β-葡萄糖苷酶是水解芳香前体物质，释放结合态糖苷配基的关键性酶，能够改善茶叶、果汁、果酒、面包等食品的风味，提升食品品质[2]。周小玲等研究发现，可利用β-葡萄糖苷酶辅助提取茶叶中的天然产物[3]；
刘芳舒等研究发现，β-葡萄糖苷酶酶解增香能在较大程度上还原刺梨汁的天然香气[4]；
孙爱东等研究发现，用β-葡萄糖苷酶处理各类葡萄酒，能够使其香气更加饱和，感官品质明显提高[5]；
钱超等研究发现，添加高产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌发酵葡萄汁酸面团，能够明显改善面包风味[6]。此外，β-葡萄糖苷酶能够在纤维素的降解过程中解除纤维二糖对内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶的产物抑制，能够水解结合于非还原性末端的β-葡萄糖苷键，同时释放出葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶主要作用于β-1，4 糖苷键，此外还可以作用于β-（1，1）、（1，2）、（1，3）、（1，6）糖苷键[7]。依据氨基酸序列的同源性和结构的相似性，已知的β-葡萄糖苷酶被归为GH1、GH3、GH5、GH9、GH30 和GH116 等6 个家族中[7-10]。近年来，关于微生物来源β-葡萄糖苷酶的报道日益增多。相比于真菌，一些细菌来源的β-葡萄糖苷酶热稳定性更强，但是产量较低。针对这些问题，研究者利用基因工程等手段，异源表达性能优越的β-葡萄糖苷酶，以提高其产量[11]。
生孢噬纤维菌是土壤中常见的好氧性纤维素分解细菌，对纤维素的降解能力十分强大。然而，由于生孢噬纤维菌不易分离纯化，研究难度较大，关于生孢噬纤维菌的纤维素降解机制尚不明确[12]。部分研究人员对生孢噬纤维菌中纤维素酶的特性进行了研究，Osmundsvag 等从生孢噬纤维菌的发酵液上清液中检测到内切葡聚糖酶的酶活力[13]，刘东波等对生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.JL-01 的纤维素酶进行了定位研究[14]。β-葡萄糖苷酶在生孢噬纤维菌降解纤维素的过程中起着十分重要的作用，但至今还未有关于生孢噬纤维菌中β-葡萄糖苷酶的报道。
为了获得酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶，作者首次从生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11的基因组中筛选出在降解纤维二糖过程中可能发挥关键作用的β-葡萄糖苷酶基因（SmBgl3A），将该基因克隆，在大肠杆菌中进行异源表达，并对其酶学性质进行了研究，为进一步扩展β-葡萄糖苷酶的种类，及对其功能及应用的探索奠定了基础。
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和质粒载体 Sporocytophaga sp.CX11：作者所在实验室分离保存；
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、大肠杆菌 BL21（DE3）、质粒pET-28a（+）：中国科学院大连物理化学研究所赵宗保研究员课题组惠赠。
1.1.2 主要试剂 Primer STAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、Protein Molecular Weight Marker、PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）、Dpn I、Pst I、Sma I、rTaq DNA 聚合酶等：大连宝日医生物股份有限公司产品；
SanProp 柱式DNA胶回收试剂盒、SanProp 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒、考马斯亮蓝G250、羧甲基纤维素钠（CMCNa）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）等：生工生物工程股份有限公司产品；
对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）：北京索莱宝科技有限公司产品；
胰蛋白胨、酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司产品；
RNA 提取试剂盒：艾科瑞生物公司产品。
1.1.3 培养基 Sporocytophaga sp.CX11 培养基（g/L）：NaNO30.5，MgSO4·H2O 0.5，KCl 0.5，K2HPO41，FeSO40.01，葡萄糖（或纤维二糖）5。
LB 培养基（g/L）：酵母浸粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10。
LLB（低盐LB）发酵培养基（g/L）：酵母浸粉5，胰蛋白胨10，NaCl 5。
1.2 主要仪器
梯度PCR 仪、高速冷冻台式离心机、电击转化仪：德国Eppendorf 公司产品；
LAS4000、AKTA 蛋白质纯化系统：美国GE Healthcare 公司产品；
超滤装置：美国Millipore 公司产品；
超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司产品；
安捷伦电泳分析仪：美国安捷伦科技有限公司产品；
酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司产品；
三层恒温摇床：伊孚森生物科技（中国）有限公司产品；
电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司产品；
ICS-5000 离子色谱仪：美国赛默飞世尔科技公司产品；
LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR 仪：瑞士Roche公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 生孢噬纤维菌总 RNA 的提取 将Sporocytophaga sp.CX11 接种至10 mL 葡萄糖或纤维二糖液体培养基中，30 ℃、200 r/min 培养36 h 制备种子液。种子液以体积比1∶50 接种量分别接种至以葡萄糖或纤维二糖为碳源的液体培养基中，培养至对数生长中前期。收集菌体，用无菌水反复洗涤，重悬至OD600为1.0，液氮速冻于-80 ℃保存备用。采用SteadyPure 通用型RNA 提取试剂盒对生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 总RNA 进行提取，操作方法参照试剂盒说明书。
1.3.2 反转录反应 利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）对所获得RNA 进行反转录。反转录体系包括200 ng RNA，1 μL PrimeScript Enzyme Mix，4 μL 5 ×PrimeScript Buffer，1 μL Random 6 Mers，1 μL Oligo dT Primer，用无RNase的水补充至20 μL，在PCR 仪中37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s。
1.3.3 实时荧光定量PCR 应用LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR 仪，进行实时荧光定量PCR 实验。体系包括10 μL TB Green Premix Ex TaqGC（2×），0.4 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.4 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L），100 ng Template 以及0.4 μL 灭菌水。经过扩增反应进行实时荧光信号的收集，根据Ct 值分析计算不同基因的相对表达量。所用实时荧光定量PCR 引物如表1所示。
表1 实时荧光定量PCR 引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR
1.3.4 β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 蛋白质序列分析通 过EMBL-EBI（https：//www.ebi.ac.uk/about）对SmBgl3A 进行二级结构预测。利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）进行同源建模，模拟SmBgl3A 的三级结构。利用NCBI BLAST（https：//novopro.cn/blast/blastp.html）进行序列同源性比对。用 Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行多重序列比对，并利用ESpript 服务器（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）进行多序列比对结果输出。
1.3.5 β-葡萄糖苷酶基因SmBgl3A 的克隆和表达载体构建 根据生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 基因组中β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的基因和表达载体pET-28a（+）的多克隆位点，设计上游引物SmBgl3A-F（CAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAAAA TCAGGATCAAAAGATTG）及下游引物SmBgl3A-R（GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTATTTAAACGAA ATGATCACC）。以基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增。扩增程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环30 次；
最后72 ℃延伸10 min。由此得到目的片段，以扩增出来的β-葡萄糖苷酶目的片段为引物，利用RF-clone（restriction-free clone）技术将目的片段克隆至pET-28a（+）载体上。随后用1.5 μL 的限制性内切酶Dpn Ⅰ消化模板，37 ℃反应10 h 以上，得到构建成功的质粒。将构建成功的质粒电击转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，挑取阳性转化子，酶切验证正确后送测序，测序结果比对正确即重组质粒鉴定正确。
1.3.6 重组β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 在大肠杆菌中表达 将鉴定正确的重组质粒热激转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，挑取阳性转化子送公司测序，将测序正确的转化子接种至LB 培养基（含终质量浓度30 μg/mL 的卡纳霉素），37 ℃、200 r/min过夜培养。将种子液以2%（体积分数）接种量接入LLB 发酵培养基，37 ℃、200 r/min 培养至OD600为0.6，加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG，16 ℃过夜诱导16 h。
1.3.7 重组β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的纯化 重组大肠杆菌诱导过夜后，收集菌体。用pH 8.0 的缓冲液重悬菌体，混合均匀后用高压匀浆破碎。于4 ℃条件下，10 000 g 离心20 min，上清液即为粗酶液，利用Ni-NTA 亲和层析进行纯化。
纯化采用AKTA 蛋白质纯化系统，用5 倍柱体积的结合缓冲液（0 mmol/L 咪唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH 8.0）平衡系统（2 mL/min）。依次用5 倍柱体积的结合缓冲液、清洗缓冲液（30 mmol/L 咪 唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH 8.0）及洗脱缓冲液（250 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH 8.0）洗脱蛋白质，收集洗脱液。分别对粗酶液及洗脱液进行SDS-PAGE 检测。利用Bradford 法测定蛋白质质量浓度。
1.3.8 重组β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的酶活力测定以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）为底物测定SmBgl3A 的酶活力，反应体系包括250 μL 1.25 mmol/L pNPG 和250 μL酶液，35 ℃反 应30 min 后，加入1 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应，在405 nm 处检测吸光度，以灭活蛋白质作空白对照，每组设置3 个平行样。
酶活力单位定义：在pH 6.5、35 ℃条件下，每分钟水解pNPG 释放出1 μmol pNP 所需要的酶量为1 U。
以纤维二糖为底物测定SmBgl3A 的酶活力，反应体系包括250 μL 1 g/dL 纤维二糖和250 μL 酶液，35 ℃反应30 min 后，沸水浴10 min 终止反应。10 000 g 离心5 min，取上清液，利用离子色谱法测定葡萄糖的生成量，离子色谱条件为：进样量为10 μL，流动相流量为0.4 mL/min，用体积分数98%的200 mmol/L NaOH 洗脱，分析柱及保护柱温度为30 ℃。以灭活蛋白质作空白对照，每组设置3 个平行样。
酶活力单位定义：在pH 6.5、35 ℃条件下，每分钟水解纤维二糖释放出1 μmol 葡萄糖所需要的酶量为1 U。
以其他底物测定SmBgl3A 的酶活力，反应体系包括250 μL 1 g/dL 的底物和250 μL 酶液，35 ℃反应30 min 后，沸水浴10 min 终止反应。10 000 g 离心5 min，取150 μL 上清液与200 μL 的DNS 试剂混合，煮沸5 min，冷却后向其中加入900 μL 的蒸馏水，在540 nm 处检测吸光度。以灭活蛋白质作空白对照，每组设置3 个平行样。
酶活力单位定义：在pH 6.5、35 ℃条件下，每分钟水解底物释放出1 μmol 还原糖所需要的酶量为1 U。
1.3.9 重组β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 酶学性质表征
1）SmBgl3A 最适反应温度和热稳定性的测定在25～80 ℃，每隔5 ℃作为一个测量点，于50 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5）中，测定酶活力。以最大值为100%，分别计算不同温度下的相对酶活力，以此确定SmBgl3A 的最适反应温度。
将SmBgl3A 酶蛋白分别在25～80 ℃条件下（每隔5 ℃作为一个测量点）孵育2 h，在最适条件下测定残余酶活力。以未经处理的酶液为对照，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比（相对酶活力），以此测定SmBgl3A 的热稳定性。
2）SmBgl3A 最适反应pH 和pH 稳定性的测定分别用不同pH 的缓冲液稀释酶液，在最适温度下反应30 min，测定酶活力。以最大值为100%，分别计算不同pH 条件下的相对酶活力，以此测定最适反应pH。缓冲体系包括：柠檬酸-柠檬酸钠体系（pH 4.0～6.0），NaH2PO4-Na2HPO4体系（pH 6.0～8.0）；
NaH2PO4-K2HPO4体系（pH 8.0～9.0）。
将SmBgl3A 酶蛋白分别在不同pH 的缓冲液中孵育2 h，然后在最适条件下测定残余酶活力。以未经处理的酶液为对照，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比（相对酶活力），以此测定SmBgl3A 的pH 稳定性。
3）SmBgl3A 的底物特异性测定 分别以1.25 mmol/L 芳香基糖苷（对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）、4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（pNPC）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNP（α）G））、终质量浓度为1 g/dL 的二糖（纤维二糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）及多糖（微晶纤维素avicel、普鲁兰糖、木聚糖、壳寡糖、几丁质、黄原胶）、滤纸、CMC-Na、水杨苷为底物，在35 ℃、pH 6.5 的条件下反应，测定产物生成量，参照1.3.8 的方法，计算酶的比活力。
4）SmBgl3A 的NaCl 耐受性测定 在酶反应体系中分别添加终浓度为0～2 500 mmol/L 的NaCl 溶液。参照1.3.8 所述方法测定残余酶活力，将不添加NaCl 的酶活力设置为100%，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比（相对酶活力）。
5）金属离子对SmBgl3A 酶活力的影响 在酶反应体系中分别加入终浓度为10 mmol/L 的Mg2+、Li+、Mn2+、Na+、Fe2+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等金属离子盐溶液及EDTA，以未添加金属离子溶液的酶活力为100%，测定金属离子对SmBgl3A 酶活力的影响。
6）SmBgl3A 的葡萄糖耐受性测定 在酶反应体系中分别添加终浓度为0～2 000 mmol/L 的葡萄糖溶液。参照1.3.8 所述方法测定残余酶活力，将不添加葡萄糖组的酶活力设置为100%，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比（相对酶活力）。
7）SmBgl3A 的酶促反应动力学参数测定 以pNPG 为底物，测定SmBgl3A 的酶促反应动力学参数。250 μL 酶液分别与等体积终浓度为0.1～5.0 mmol/L 的pNPG 溶液混合，测定反应初速度，确定反应时间，计算不同底物浓度下的反应速度，采用双倒数作图法，以1/[S]为横坐标，1/V 为纵坐标，计算动力学参数。
以纤维二糖为底物，测定SmBgl3A 的酶促反应动力学参数。250 μL 酶液分别与等体积终浓度为0.5～50.0 mmol/L 的纤维二糖溶液混合，测定反应初速度，确定反应时间，计算不同底物浓度下的反应速度，采用双倒数作图法，以1/[S]为横坐标，1/V 为纵坐标，计算动力学参数。
2.1 生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 中不同β-葡萄糖苷酶基因的表达水平分析
通过基因注释以及NCBI 数据库比对分析，在生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 基因组中共挖掘到7 个β-葡萄糖苷酶基因。其中，所对应的蛋白酶SmBgl1A 为GH1 家族的糖苷水解酶，SmBgl3A、SmBgl3B、SmBgl3C、SmBgl3D、SmBgl3E 以及SmBgl3F 均为GH3 家族的糖苷水解酶。为了从中筛选出在降解纤维二糖过程中起关键作用的β-葡萄糖苷酶，利用实时荧光定量PCR 技术对上述编码基因在不同碳源培养条件下的相对表达水平进行了分析。结果如图1 所示，7 个β-葡萄糖苷酶基因在以纤维二糖为碳源的培养基中的表达水平均高于以葡萄糖为碳源的培养基中的表达水平，其中SmBgl3A 在以纤维二糖为碳源的培养基中的表达水平是在以葡萄糖为碳源的培养基中表达水平的18 倍，上调最为显著。且SmBgl3A 的表达量相对较高，推测其可能在生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 降解纤维二糖的过程中发挥关键作用，解除纤维二糖对内切纤维素酶及外切纤维素酶的产物抑制作用，提高Sporocytophaga sp.CX11 菌株降解纤维素的效率。
图1 生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 β-葡萄糖苷酶基因在不同碳源条件下的相对表达量Fig.1 Relative expression level of β-glucosidase genes from Sporocytophaga sp.CX11 in different carbon sources
2.2 新型β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的序列分析
SmBgl3A（NCBI 登录号No.OL653716）编码的蛋白质由760 个氨基酸组成，该蛋白质由信号肽、GH3 催化结构域及Fibronectin type Ⅲ-like domain（FnⅢ）结构域组成。其中，GH3 催化结构域主要由22 个α-螺旋和17 个β-折叠构成，FnⅢ结构域主要由8 个β-折叠组成，这种结构在GH3 家族β-葡萄糖苷酶中普遍存在[21]。图2 为SmBgl3A 与PDB 数据库中GH3 家族β-葡萄糖苷酶多重氨基酸序列比对结果，其中SmBgl3A 与Bacteroides ovatus 来源的BoGH3B[15]（NCBI 登录号No.WP_004298458.1）的同源性最高，为46.76%。据报道，在GH3 家族β-葡萄糖苷酶中，参与催化反应的氨基酸主要包括一个亲核催化残基和一个酸/碱催化残基。其中，亲核催化残基非常保守，通常是天冬氨酸，而作为广义酸碱对的催化残基却并不保守[22]，一般为谷氨酸。经过比对分析推断，SmBgl3A 保守的亲核催化残基为D308。
图2 β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 与其他GH3 家族β-葡萄糖苷酶多重氨基酸序列比对结果Fig.2 Multiple amino acid sequences blast of β -glucosidase SmBgl3A with other β-glucosidase from GH3 families
2.3 重组β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的表达与纯化
将重组大肠杆菌菌株接种至LLB 培养基中，培养至OD600达到0.6 左右时加入IPTG 诱导培养16 h。SDS-PAGE 分析结果（见图3）表明，SmBgl3A 表达量相对较高，经纯化后，得到电泳纯的目的蛋白质，且与理论相对分子质量（8.12×104）一致。酶活力测定结果显示，以pNPG 为底物时，SmBgl3A 的比活力为 14.74 U/mg。该酶的比活力高于细菌Actinomadura amylolytica YIM 77502T[22]（4.6 U/mg）来源、真菌Sporothrix schenckii[23]（0.801 U/mg）来源、植物Cyamopsis tetragonoloba[24]（6.6 U/mg）来源的β-葡萄糖苷酶。
图3 重组蛋白质SmBgl3A 亲和层析纯化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of SmBgl3A by affinity chromatography
2.4 重组β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的酶学性质分析
2.4.1 温度和pH 对SmBgl3A 酶活力的影响SmBgl3A 的最适反应温度曲线如图4（a）所示，在25～35 ℃时，酶活力随着反应温度的升高而升高，35 ℃时酶活力最高；
随着温度的继续升高，酶活力逐渐降低，60 ℃时基本失活。热稳定性结果如图4（b）所示，SmBgl3A 在40 ℃条件下孵育2 h 后仍保留40%以上的酶活力，45 ℃条件下稳定性有较大幅度的下降。最适pH 结果如图5（a）所示，SmBgl3A 在pH 6.5 时酶活力最高，在pH 5.0～8.0 时可表现出50%以上的相对酶活力。pH 稳定性结果如图5（b）所示，SmBgl3A 在pH 5.0～7.0 的条件下，在35 ℃孵育2 h 后，残余酶活力（相对酶活力）在50%以上；
在pH 低于4.5 及pH 高于8.0 时，残余酶活力有较大幅度的下降，说明SmBgl3A 有一定的酸碱适应能力。GH3 家族β-葡萄糖苷酶的最适温度一般较高，多在50～70 ℃，且具有较好的热稳定性，例如来源于Bifidobacterium adolescentis[25]的β-葡萄糖苷酶BaBgl3 的最适温度为45 ℃，来源于Penicillium citrinum UFV1[21]的β-葡萄糖苷酶PcβGlu2 在50 ℃孵育13 h，仍能保持50%的酶活力，这种特性对于工业应用来说非常有利[16]；
GH3 家族β-葡萄糖苷酶的最适pH 一般在4.0～6.5，且在酸性范围内稳定性较好[17]，例如来源于Penicillium citrinum UFV1[26]的β-葡萄糖苷酶PcβGlu1 最适pH 为5.0，且在pH 4.0～8.0 时稳定性较好，与SmBgl3A 的pH 稳定性类似。
图4 重组蛋白质SmBgl3A 的最适温度及热稳定性Fig.4 Optimal temperature and thermal stability of recombinant protein SmBgl3A
图5 重组蛋白质SmBgl3A 的最适pH 及pH 稳定性Fig.5 Optimum pH and pH stability of recombinant protein SmBgl3A
2.4.2 SmBgl3A 的底物特异性分析 SmBgl3A 的底物特异性分析结果如表2 所示，SmBgl3A 对芳香族底物pNPG 和pNPX 具有水解活性，且对pNPG 的活性最高。除此之外，SmBgl3A 还能水解pNPC，这意味着其可以水解纤维寡糖，但是对pNP（α）G 不具有活性。在天然底物中，SmBgl3A 对纤维二糖活性最高，其次是水杨苷，对蔗糖、CMC-Na、avicel 和普鲁兰糖有微弱的酶活力，对麦芽糖、乳糖、黄原胶、木聚糖、壳寡糖、几丁质、滤纸均未检测到活性。GH3 家族的β-葡萄糖苷酶可水解的底物类型很多样，除可强烈水解pNPG 外，部分β-葡萄糖苷酶还可水解4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖等[27]。
表2 SmBgl3A 的底物特异性Table 2 Substrate specificity of SmBgl3A
2.4.3 NaCl 对SmBgl3A 酶活力的影响 测定NaCl对SmBgl3A 酶活力的影响，结果如图6 所示。NaCl浓度在0～400 mmol/L 时，SmBgl3A 的酶活力有小幅度下降，但仍能保留90%以上活性；
NaCl 浓度在400～800 mmol/L 时，酶活力相对稳定，相对酶活力约为90%；
当NaCl 浓度在800～2 500 mmol/L 时，SmBgl3A 酶活力开始较大幅度降低，但是当NaCl浓度达到2 500 mmol/L 时，仍能保留约50%的活性。据报道，只有少数的β-葡萄糖苷酶具有较好的NaCl 耐受性，如来源于Alteromonas sp.L82 的β-葡萄糖苷酶Bgl[28]在NaCl 浓度为1 000 mmol/L 时的相对酶 活力为 90.7%，来源于 Bacillus cellulosilyticus 的β-葡萄糖苷酶BcBgl1A[29]在NaCl浓度为1 000 mmol/L 时的相对酶活力为62.3%。而在相同NaCl 浓度下，SmBgl3A 仍能保存80%以上的相对酶活力，说明SmBgl3A 具有较好NaCl 耐受性。在工业应用中，β-葡萄糖苷酶在复杂的外部环境中仍能保持活性非常重要，较好的NaCl 耐受性使β-葡萄糖苷酶在工业上具有更大的应用潜力，可以尝试应用于海洋食品加工、生物乙醇生产等领域[30]。
图6 重组蛋白质SmBgl3A 的NaCl 耐受性Fig.6 NaCl tolerance of recombinant protein SmBgl3A
2.4.4 金属离子对SmBgl3A 酶活力的影响 在酶反应体系中分别加入终浓度为10 mmol/L 的Mg2+、Li+、Mn2+、Na+、Fe2+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等金属离子盐溶液及EDTA，测定金属离子对SmBgl3A 酶活力的影响（见图7）。结果表明，Mg2+和Li+对酶活力有少许激活作用，相对酶活力分别达104%和103%；
其余8 种金属离子及EDTA 对酶活力均有抑制作用，其中Fe3+能够完全抑制酶活力。一般而言，金属离子对不同β-葡萄糖苷酶的活性影响有很大区别。梁金凤等分离获得的β-葡萄糖苷酶，其酶活力经Zn2+激活，受Fe2+抑制，而Cu2+、EDTA 对其活性基本无影响[33]。王剑锋等分离获得的β-葡萄糖苷酶，酶活力经Fe2+激活，被Cu2+抑制[34]。
图7 金属离子对SmBgl3A 酶活力的影响Fig.7 Effect of metal ions on the enzyme activity of SmBgl3A
2.4.5 葡萄糖对SmBgl3A 酶活力的影响 测定葡萄糖对SmBgl3A 酶活力的影响，结果如图8 所示，SmBgl3A 的IC50 小于25 mmol/L，对葡萄糖较敏感。正如报道的那样，GH3 家族的β-葡萄糖苷酶的IC50 通常小于100 mmol/L[31]。提高SmBgl3A 对葡萄糖的耐受性，对其在工业中的应用具有十分重要的意义。
图8 重组蛋白质SmBgl3A 的葡萄糖耐受性Fig.8 Glucose tolerance of recombinant protein SmBgl3A
2.4.6 SmBgl3A 酶促反应动力学分析 测定SmBgl3A 水解pNPG 及纤维二糖的酶促反应动力学参数，结果如表3 所示，SmBgl3A 对pNPG 的亲和力较好，催化效率更高。SmBgl3A 对纤维二糖的催化效率远高于Actinomadura amylolytica YIM 77502T[22]来源的β-葡萄糖苷酶（10.7 s-1）。同时SmBgl3A 对pNPG 的催化效率也高于Actinomadura amylolytica YIM 77502T 来源的β-葡萄糖苷酶（5.5 s-1）。
表3 SmBgl3A 的动力学参数Table 3 Kinetic parameters of SmBgl3A
从生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 基因组中筛选出在纤维二糖降解过程中起关键作用的β-葡萄糖苷酶基因（SmBgl3A），该基因编码的蛋白质同一些已报道的GH3 家族β-葡萄糖苷酶氨基酸序列同源性较高，其中，与Bacteroides ovatus 来源的β-葡萄糖苷酶BoGH3B 同源性为46.76%。将该基因在大肠杆菌中异源表达，得到纯酶相对分子质量为8.12×104。SmBgl3A 的最适 底物为pNPG，对pNPG 比活力高达14.74 U/mg，最适pH 为6.5，最适温度为35 ℃，且pH 在5.0～7.0、温度在40 ℃以下时，稳定性较好。SmBgl3A 具有较好的NaCl 耐受性，使其在食品、药品等工业领域的应用更为广泛。但SmBgl3A 的酶活力及稳定性还有待提高，糖基化修饰是改善酶活力及稳定性的有效手段。经过糖基化位点的预测可知，SmBgl3A 存在4 个潜在的N-糖基化位点（N137、N161、N459、N483）。有研究表明，将细菌来源的基因在毕赤酵母中表达时，分泌表达的酶蛋白会被糖基化修饰，能够明显改善酶的热稳定性[32]。在后续研究中，可将SmBgl3A 的基因在毕赤酵母中异源表达，以提高酶活力及稳定性。作者将一种新型的来自于生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11 的β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中进行异源表达，并对重组蛋白质的酶学性质进行了表征，为挖掘新型β-葡萄糖苷酶及其功能应用奠定了基础，也为该酶的进一步工业化应用提供参考与借鉴。
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