余方方 吴艳秋 黄 翠 李定富
(海南西部中心医院检验科， 海南省儋州市 571700)
因多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者的骨髓浆细胞具有克隆性异常增生的特点，患者化疗后易发生免疫功能紊乱，病死风险增加[1]。免疫细胞是指参与机体免疫应答或与免疫应答相关的细胞，主要包括Th17、调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocyte，Treg)、中性粒细胞、淋巴细胞等[2]。Th17与Treg比值(Th17/Treg)主要受Th17、Treg水平变化的影响，两者可调控机体的免疫应答[3]。中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophils-to-lymphocytes ratio，NLR)主要受中性粒细胞、淋巴细胞计数的影响，其能够反映机体的免疫功能[4]。研究表明，肿瘤组织可分泌白细胞介素1及肿瘤坏死因子，使中性粒细胞过表达，而中性粒细胞过表达可改变肿瘤组织的生长环境，利于肿瘤生长[5]。由此推测，免疫细胞异常表达可能对接受化疗的MM患者的预后产生影响。因此，本研究分析MM患者化疗后近期病死的影响因素，探讨Th17/Treg及NLR对MM患者化疗后近期病死风险的预测价值，为早期评估MM患者化疗后病死风险并及时进行干预提供参考。
1.1 临床资料 选取2018年1月至2019年1月在我院接受化疗的51例MM患者作为研究对象，其中男性29例、女性22例，年龄45～62(54.63±3.51)岁，成熟浆细胞23例、原幼浆细胞28例。纳入标准：(1)符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2015年修订)》[6]中MM的诊断标准，均为初诊患者；
(2)接受PAD方案(硼替佐米+地塞米松+阿霉素)化疗，每4周为1个疗程，共3个疗程；
(3)既往无放化疗史；
(4)无高血压、糖尿病等基础疾病。排除标准：伴重要脏器疾病、严重传染性疾病或感染性疾病、免疫系统性疾病、凝血功能障碍、其他恶性肿瘤及因其他疾病或意外死亡的患者。所有患者及家属均对本研究知情同意，本研究已通过我院医学伦理委员会审批。
1.2 研究方法
1.2.1 收集患者的一般临床资料：收集患者年龄、性别、骨髓活检结果、溶骨性损害情况、确诊MM至接受化疗时间、MM亚型等资料。
1.2.2 血液生化指标的检测：(1)于患者首次化疗当天，抽取患者空腹外周静脉血9 mL。取5 mL静脉血以3 000 r/min离心15 min(离心半径为10 cm)分离血清，使用全自动生化分析仪(桂林优利特医疗电子有限公司，型号：CA-800C)检测血清钙水平，采用相应ELISA试剂盒检测血清缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α；
上海抚生实业有限公司，批号：FS15692)、程序性死亡配体 1(programmed death ligand 1，PD-L1；
上海江莱生物科技有限公司，批号：JL47442)水平；
取剩余4 mL静脉血，使用全自动血细胞分析仪(南京贝登医疗股份有限公司，型号：BC-5000)检测患者的血红蛋白水平、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数，并计算NLR。血清钙正常值为2.25～2.75 mmol/L，血清HIF-1α正常值为(23.15±6.69)ng/L，血清PD-L1正常值为0.06～6.06 ng/mL，血红蛋白正常值为男性120～160 g/L、女性110～150 g/L，NLR正常值为0.8～1.2。(2)于MM患者首次化疗当天，抽取患者空腹静脉血6 mL存放于含有枸橼酸钠抗凝液试管，加入等体积Hank′s液稀释后取1 mL淋巴细胞分离液，室温下以1 500 r/min离心15 min，用毛细吸管吸出单个核细胞层后加入5 mL的Hank′s液充分混匀，以1 500 r/min离心10 min后弃上清液再次清洗。使用流式细胞仪(湖南层浪生物科技有限公司，型号：MateCyte 2L6C)检测Th17和Treg水平，并计算Th17/Treg。Th17/Treg的正常范围为1.81～8.08。
1.2.3 近期预后评估：MM患者于3个化疗疗程结束后接受为期1年的随访。观察并记录全部患者随访期间因MM病情恶化的病死情况，将病死患者纳入病死组，其余患者纳入生存组。
1.3 统计学分析 采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验；
正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，非正态分布的计量资料以[M(P25，P75)]表示，组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验；
采用Pearson检验分析检测外周血Th17/Treg与NLR的相关性；
采用多因素Logistic回归模型分析MM患者化疗后1年内病死的影响因素；
采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析外周血Th17/Treg、NLR预测MM患者化疗后1年内病死的效能。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 病死组与生存组一般临床资料及血液生化指标的比较 在随访期间，51例MM患者中共10例患者因MM病情恶化死亡(19.61%)。病死组与生存组患者的年龄、性别、骨髓活检结果、溶骨性损害发生情况、MM亚型、确诊至接受化疗时间、血红蛋白水平及血清钙水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；
病死组患者血清HIF-1α、PD-L1水平，以及外周血Th17/Treg、NLR均高于生存组(均P<0.05)。见表1。
表1 病死组与生存组一般临床资料及血液生化指标的比较
2.2 MM患者化疗后病死的影响因素 将MM患者化疗后1年内病死情况设为因变量(1=病死，0=生存)，将2.1中有统计学意义的指标设为自变量(均为连续变量)，纳入多因素Logistic回归分析。结果显示，血清HIF-1α、PD-L1水平，以及外周血Th17/Treg、NLR均是MM患者化疗后1年内病死的影响因素(均P<0.05)。见表2。
表2 多因素Logistic回归分析结果
2.3 外周血Th17/Treg和NLR预测MM患者化疗后1年内病死的效能 以MM患者化疗预后作为状态变量(“1”=病死；
“0”=存活)，以Th17/Treg、NLR作为检验变量，绘制ROC曲线。结果显示，外周血Th17/Treg、NLR单独及二者联合预测MM患者化疗后1年内病死风险的曲线下面积分别为0.755、0.737、0.818，均有良好的预测效能，以二者联合预测效能最高。见表3、图1。
表3 各指标预测MM患者化疗后病死风险的效能分析
图1 外周血Th17/Treg、NLR单独及联合预测MM患者化疗后1年内病死的ROC曲线图
2.4 MM患者外周血Th17/Treg与NLR的相关性 相关性分析结果显示，MM患者外周血Th17/Treg与NLR呈正相关(r=0.374，P=0.007)。
MM在血液系统恶性肿瘤中较为常见，既往主要使用硼替佐米治疗，但效果不尽人意[7]。目前临床上多采用PAD方案治疗MM，多数患者的治疗效果良好，但部分MM患者免疫功能异常，化疗后病情仍有恶化趋势，从而出现不良预后[8]。梁赜隐等[9]发现，约有20%MM患者(接受硼替佐米为基础的化疗方案治疗)在化疗开始后1年内死亡。本研究结果显示，51例经PAD方案化疗的MM患者1年内的病死率为19.61%，与上述研究结果相似，这提示MM患者化疗后1年内病死率较高。研究表明，缺氧、协同刺激因子在肿瘤发生、发展中起着关键性作用[10]。HIF-1α可增加肿瘤细胞的侵袭性，增加肿瘤远处转移的风险[11]。肿瘤细胞快速增殖导致需氧量增加，局部氧气弥散减少导致肿瘤细胞处于低氧微环境，低氧状态下HIF-1α可不断刺激内皮细胞增生，为肿瘤细胞的血供和氧气需求提供有利条件，这是肿瘤细胞增殖的重要机制[12]。作为主要的协同刺激因子，PD-L1通常在活化B淋巴细胞、T淋巴细胞等细胞中表达，研究表明，PD-L1在乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤患者，甚至部分血液系统恶性疾病患者中呈过表达[13]。本研究结果显示，病死组血清HIF-1α、PD-L1水平均高于生存组，且血清HIF-1α、PD-L1水平均是MM患者化疗后1年内病死的影响因素(均P<0.05)。这可能是因为PD-L1能够向T淋巴细胞传递抑制信号，使得T淋巴细胞活性减弱，造成肿瘤免疫抑制，机体抗肿瘤能力减弱，从而导致肿瘤细胞发生免疫逃逸[14]。因此，MM患者化疗后机体免疫抑制状况可增加肿瘤复发风险，导致病情恶化，增加病死风险。
研究表明，Th17可释放白细胞介素、肿瘤坏死因子等多种炎症因子，加速炎症反应的发生，进一步加重肿瘤患者的病情[15]，而Treg可调节机体抗炎因子与促炎因子之间的平衡[16]。中性粒细胞是反映机体炎症反应的主要指标之一，中性粒细胞升高可直接影响宿主细胞的免疫功能，降低宿主细胞的抗癌能力。同时，中性粒细胞可释放大量血管内皮生长因子，使毛细血管增生，为肿瘤的生长及转移提供有利条件。淋巴细胞能够阻止肿瘤细胞增殖及迁移，发挥抗肿瘤作用[17]；
淋巴细胞减少可降低机体的抗肿瘤能力，且淋巴细胞与机体免疫反应密切相关[18]。相比于单独检测中性粒细胞或淋巴细胞，NLR更能有效反映机体的炎症反应程度[19]。因此，本研究检测MM患者的外周血Th17/Treg及NLR，结果显示，病死组患者外周血Th17/Treg、NLR均高于存活组，外周血Th17/Treg、NLR均是MM患者化疗后1年内病死的影响因素，且MM患者外周血Th17/Treg与NLR呈正相关(均P<0.05)。这表明MM患者的外周血Th17/Treg、NLR相互作用并共同参与MM的疾病进展，两者升高均提示MM患者有预后不良风险。本研究的ROC曲线结果显示，外周血Th17/Treg、NLR单独及二者联合预测MM患者化疗后1年内病死风险的曲线下面积分别为0.755、0.737、0.818，均有良好的预测效能，以二者联合预测效能最高。这提示对于外周血Th17/Treg、NLR均升高的MM患者，应考虑存在化疗后病情恶化的可能，须积极做好防治措施。
综上所述，血清HIF-1α、PD-L1水平升高，以及外周血Th17/Treg、NLR升高的MM患者化疗后1年内病死的风险增加。外周血Th17/Treg、NLR单独及二者联合对MM患者化疗后1年内病死均具有良好的预测效能，以二者联合预测效能最高。
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