何 达， 马子越， 席俊峰
(陕西省榆林市第一医院呼吸与危重症医学科, 陕西 榆林 719000)
肺癌发病率高、死亡率高，给我国医疗卫生造成了沉重的社会负担。因为肺癌诊断时往往处于晚期，已经错过了治疗的最佳时机，导致肺癌的死亡率居高不下[1]，因此寻找新的生物标志物与治疗靶点对于肺癌的治疗非常重要。干细胞是未分化的细胞，具有自我更新能力和多能性，在临床治疗中具有巨大的潜力[2]。既往研究表明，癌症干细胞作为未分化的肿瘤细胞亚群，可适应放射/化学疗法并继续生长。癌症干细胞的干细胞特性主要受其微环境调控，具有无限增殖和自我更新的能力，可改变与癌症干细胞相关的信号通路，促进癌症的发生、转移、治疗耐药和疾病的复发[3]。传统的癌症治疗旨在消除增殖的癌细胞，然而针对癌干细胞的治疗策略仍然是一项重大挑战。小环状RNA(microRNA，miRNA)是一种高度保守的内源性非编码小分子RNA，在生物体内长度约为18-24个核苷酸，可以在翻译水平上调控基因表达。miRNA 在影响许多细胞过程的基因表达中具有关键的调节作用，包括生长、增殖、分化、代谢和细胞死亡。miRNA的异常表达和失调与多种人类疾病有关，包括癌症、自身免疫性疾病以及心血管和神经系统疾病[4]。miR-653是miRNA的一种，研究表明miR-653失调可能与癌症、缺氧和中风等许多疾病的过程有关，对于疾病的发展发挥不同的影响。然而miRNA调控网络对肺癌干细胞的干性维持的调控作用有待进一步的研究。本实验基于miRNA调控网络，探讨其在肺癌干细胞干性维持中的作用及其分子机制，通过miRNA-seq寻找正常肺癌组织与癌旁组织中的差异miRNA，并进行靶mRNA预测，为将来研究肺癌的免疫疗法提供参考价值。
1.1临床资料：选取2019年6月至2022年3月期间于我院手术切除的肺癌组织和癌旁组织(40例)。手术取材后立即置于液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。所有患者术前均未接受放化疗。本研究经我院伦理委员会批准，并取得患者知情同意。
1.2细胞与主要仪器试剂：H460肺癌细胞系购自中科院上海细胞库；
PBS、胎牛血清、胰酶消化液和RPMI-1640培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；
TRizol试剂购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；
High Capacity Complementary DNA 逆转录试剂盒购自美国Life Technologies Corporation；
LipofectamineTM 2000转染试剂购自美国Invitrogen；
荧光素酶活性检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；
miR-NC质粒、miR-653质粒、过表达载体阴性对照(oe-NC)、MYC过表达载体(oe-MYC)购自武汉金开瑞生物工程有限公司；
SYBR Green试剂购自上海翌圣公司；
GAPDH引物、miR-653引物、MYC引物由上海生工生物工程公司合成；
CCK8试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司；
荧光标记抗体 (FITC-CD133、PE-CD24)均购自美国eBioscience公司。
1.3miRNA-seq；
使用TRizol试剂提取人的肺癌组织与癌旁组织的总RNA(各5例)，然后，通过凝胶电泳分离大小为18～-30nt的RNA分子，并将3"和5"接头连接到RNA。使用High Capacity Complementary DNA 逆转录试剂盒对每个样品的1μg RNA进行逆转录，富集140～160 bp大小的PCR产物构建cDNA文库。使用 Illumina HiSeq 2500测序系统进行高通量测序。通过背景校正、log2变换和分位数归一化对数据进行预处理。通过使用Benjamini-Hochberg 程序对多重比较进行校正。
1.4细胞培养及传代：使用RPMI-1640培养基(含10%优质胎牛血清与青链霉素混合双抗)培养H460肺癌细胞，培养条件：气相：空气，95%；
二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养：弃去培养上清，PBS润洗细胞1-2次，加2mL胰酶消化液于培养瓶中消化1-2min，加少量培养基终止消化。按6～8mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1∶2到1∶5的比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中继续培养。
1.5生物信息学技术预测miR-653的靶mRNA及其参与的信号通路：利用TargetScan7数据库(http://www.targetscan.org/vert_71/)和LncRNA2Target数据库(http://123.59.132.21/lncrna2target/index.jsp)预测miR-653的靶基因，结果通过Cytoscape软件作图导出。使用KEGG数据库(KEGG Database https://www.kegg.jp/kegg/kegg1.html)分析分析miR-653靶基因参与的信号通路。
1.6细胞转染与荧光素酶报告基因检测实验：收集对数生长期的H460细胞接种至6孔板，根据LipofectamineTM 2000说明书进行转染，将miR-NC、miR-653、oe-NC、oe-MYC转染至H460肺癌细胞系，分组为：miR-NC组(转染miR-NC)、miR-653组(转染miR-653)、miR-653+oe-NC组(转染miR-653+ oe-NC)、miR-653+oe-MYC组(转染miR-653+oe-MYC)，转染48h后进行后续实验检测；
分别将miR-NC、miR-653、野生型MYC、突变型MYC转染至H460肺癌细胞中，分组为：野生型MYC+miR-NC组、野生型MYC+miR-653组、突变型MYC+miR-NC组、突变型MYC+miR-653组。转染48h后，将细胞铺板至96孔板，应用荧光素酶活性检测试剂盒检测H460肺癌细胞的荧光素酶活性。依据以下公式进行计算:相对luciferase活性=firefly luciferase活性/ renilla luciferase活性× 100%。
1.7CCK8实验检测细胞增殖水平：将对数阶段生长的各组H460细胞接种于96孔板，每孔细胞数为1×104。细胞继续培养24h后，如前所述处理和转染细胞。将细胞培养24h后，然后每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃培养4h。通过酶标仪测量450nmoL/L的光密度(OD)值。细胞增殖(%)=(其余组OD450)/0ng/L DEXOD450)×100%。
1.8有限稀释法检测细胞成球实验：收集转染后的H460细胞，进行消化、离心，加入含TGF生长因子的无血清培养基并吹打分散为单细胞悬浮液，调整细胞数量以4、8、16个/孔接种于96孔板，每组6个孔。置于37℃、CO2恒温孵育箱中培养，1周后于倒置显微镜下观察并计数每视野下形成的细胞球，以>50μm作为一个细胞球。成球频率=(对应孔阳性细胞数/4+对应孔阳性细胞数/8+对应孔阳性细胞/16)×100%。
1.9qRT-PCR法检测肿瘤组织或细胞基因的表达：TRIzol试剂提取总RNA，酶标仪检测总RNA的纯度和含量。按照qRT-PCR试剂盒实验说明，依次进行逆转录和qRT-PCR实验。qRT-PCR反体系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5μL，ddH2O补充至10μL。qRT-PCR反应条件：95oC(30s)预变性后，变性95oC(7s)，退火55oC(30s)，72℃(15s)，40个循环周期。扩增结果根据2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。qRT-PCR引物序列：GAPDH-F，5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3，GAPDH-R，5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3；
miR-653-F，5-TCAGGGGCCTTCAGGACTAA-3，5-CCGAGGTGTTCAAACAATCT-3；
MYC-F,5-AGTTCTAAGGCACCGGCTTC-3，MCY-R，5-GTCCTCCCCAGTCTCCTCAT-3。
1.10流式细胞术检测CD133+与CD24+细胞比例：收集H460细胞，细胞处理计数后，用细胞洗液(含2%胎牛血清的PBS)重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL，空白对照管不加抗体，同型对照和待测管分别加入10μL同型抗体和靶标抗体，充分混匀，经室温避光孵育30min孵育，期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应，孵育结束后，反复洗涤2次弃上清，使用100μL细胞洗液重悬细胞，分别加入FITC-CD133、PE-CD24抗体，充分混匀，至4℃避光孵育30min，加入100μL细胞洗液后上机检测。
2.1肺癌组织与癌旁组织中miRNA差异比较：miRNA-seq结果显示，与癌旁组织比较，肿瘤组织中有326个miRNA表达升高，363个miRNA表达降低，见图1A。qRT-PCR结果显示，癌旁组织比较，肿瘤组织中miR-653表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1B。
图1 癌旁组织和肿瘤组织差异miRNA比较注：A为癌旁组织和肿瘤组织差异miRNA比较；
B为癌旁组织和肿瘤组织miR-653表达水平比较。与癌旁组织比较，＊P<0.05
2.2miRNA调控网络预测：对miR-653进行靶mRNA预测。结果显示，miR-653靶向22个mRNA，见图2A。KEGG分析miR-653靶基因参与调控多能性干细胞等信号通路，见图2B。预测结果显示，miR-653与MYC有9个碱基互补。荧光素酶报告实验结果显示，在野生型MYC中，miR-653组荧光强度低于miR-NC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；
在突变型MYC中，miR-653组和miR-NC组荧光强度没有显著性差异(P>0.05)，见图3。
图2 miR-633靶基因预测及功能分析注：A为miR-653靶基因预测；
B为miR-653靶基因KEGG分析
图3 miR-633靶向MYC验证注：A为miR-653与MYC结合位点；
B为荧光素酶报告基因实验检测各组细胞相对荧光强度。与miR-NC组比较，＊P<0.05
2.3miR-653与MYC对肺癌细胞CD133、CD24表达的影响：qRT-PCR结果显示，与miR-NC组比较，miR-653组miR-653表达升高，MYC表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；
与miR-653+oe-NC组比较，miR-653+oe-MYC组MYC表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。流式细胞术结果显示，与miR-NC组比较，miR-653组CD133、CD24表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；
与miR-653+oe-NC组比较，miR-653+oe-MYC组CD133、CD24表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5。
图4 各组细胞miR-633、MYC表达水平的比较注：A为miR-653表达水平；
B为MYC表达水平。与miR-NC组比较，＊P<0.05；
与miR-NC+oe-NC组比较，#P<0.05
图5 各组细胞CD133、CD24表达水平的比较注：与miR-NC组比较，＊P<0.05；
与miR-NC+oe-NC组比较，#P<0.05
2.4miR-653与MYC对肺癌细胞增殖的影响：CCK8结果显示，与miR-NC组比较，miR-653组细胞增殖水平降低，在72h时表现出显著性差异(P<0.05)；
与miR-653+oe-NC组比较，miR-653+oe-MYC组细胞增殖水平升高，在72h时表现出显著性差异(P<0.05)，见图6。
图6 各组细胞增殖水平的比较注：与miR-NC组比较，＊P<0.05；
与miR-NC+oe-NC组比较，#P<0.05
2.5miR-653与MYC对肺癌细胞干性成球比例的影响：细胞成球结果显示，与miR-NC组比较，miR-653组细胞成球比例降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；
与miR-653+oe-NC组比较，miR-653+oe-MYC组细胞成球比例升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图7。
图7 各组细胞成球频率的比较注：与miR-NC组比较，＊P<0.05；
与miR-NC+oe-NC组比较，#P<0.05
肿瘤被认为是一种由细胞克隆而起源的疾病，其特点是单个转化细胞获得产生异质肿瘤细胞群的能力，每个子细胞具有相同的产生更多肿瘤细胞的能力。最近，越来越多的研究提出了癌症干细胞模型，癌症干细胞样细胞可以通过成体干细胞或祖细胞的重编程产生，这些细胞负责肿瘤的发生、发展和转移[5]。此外研究发现，肿瘤干细胞样细胞有助于肿瘤产生耐药性，极大的增加了复发和转移率。这些干细胞样细胞与传统干细胞相似，它们能够自我更新、不对称分裂[6]。鉴于这些特性，了解和开发靶向癌症干细胞的免疫疗法已成为癌症研究的重要领域。
基因表达的调控是一个复杂的多步骤过程。产生功能性蛋白质受多种因素的影响，从转录到翻译，然后是翻译后修饰，其中miRNA参与大多数过程并在这个高度复杂的调节系统中发挥关键作用[7]。近年来，越来越多的研究发现，miRNA与癌症干细胞的干性维持相关，例如Ma等[8]研究发现miR-139-5p可逆转结肠癌癌症干细胞的干性维持和上皮间质转化，抑制肿瘤的生长及转移。miR-653表达的变化与人类癌症的肿瘤侵袭性和不良预后有关，并且在某些类型的癌症中发挥肿瘤抑制作用，例如乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肾癌和肺癌[9]。miRNA通过精确调节基因表达而广泛参与各种生命过程，miRNA通过靶向mRNA的3"UTR、5"UTR、编码序列或基因启动子，介导细胞质中的转录后基因沉默或激活[10]。本实验通过使用miRNA-seq技术检测肺癌组织与癌旁组织中的差异miRNA，结合qRT-PCR结果，发现与癌旁组织比较，肺癌组织中miR-653表达显著降低。miR-653的预测靶基因KEGG分析显示，这些基因参与调控多能性干细胞等信号通路，并且miR-653表达上调可以抑制癌细胞增殖与成球比例，说明miR-653在肺癌的发生发展中发挥关键性的作用。
MYC蛋白是一螺旋-环-螺旋结构的亮氨酸拉链转录因子，可协调细胞生长、增殖、侵袭、扩张和血管生成所必需的多种转录程序。MYC在多种癌症疾病中过表达，MYC的靶基因众多，这些基因几乎在细胞生物学和肿瘤学的各个方面发挥作用。MYC激活后可以广泛抑制miRNA表达，激活抗凋亡蛋白，并参与调节癌细胞存活和耐药性[11]。例如，有研究发现在B细胞淋巴瘤中，miR-29家族与MYC表达呈负相关，并调节癌细胞生长和存活[12]。此外，已有研究表明miR-653可能通过MYC抑制成纤维细胞活力和迁移水平，提示miR-653可能靶抑制MYC从而发挥细胞生物学功能[13]。在本实验中，通过对miR-653的靶mRNA进行预测，发现miR-653与MYC的mRNA有9个碱基互补。miR-653表达增加后，MYC的表达水平降低，提示miR-653可能通过靶向MYC发挥调节作用。
随着研究地不断深入，越来越多的肿瘤干细胞表面标志物被确立，并应用于干细胞的鉴别与分选[14]。CD133和CD24均为肿瘤干细胞的特征性表面标志物，CD133+细胞与CD24+细胞均表现为更强的增殖能力和不良的预后[15]。在本实验中，miR-653组的CD133、CD24的表达降低，说明上调miR-653的表达可以抑制癌症细胞的干性，然而当过表达MYC后，CD133、CD24表达升高，说明过表达MYC可以逆转miR-653对癌细胞干性的抑制作用。此外，过表达MYC也可以逆转miR-653上调造成的癌细胞增殖下降与成球比例降低。以上结果表明，MYC位于miR-653信号调节的下游，miR-653可以通过抑制MYC降低癌症干细胞的干性维持。
综上所述，在肺癌组织中，存在miR-653的表达下调。通过上调miR-653的表达可以抑制癌细胞的干性及增殖能力，miR-653可以靶向调控MYC抑制肺癌细胞干细胞维持。以上结果初步明确了miRNA调控网络在肺癌细胞干性维持中所发挥的作用，为进一步探索肺癌的治疗靶点提供一定的参考意义。
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