张 聪，程婵婵，郝 洁，姚路路，卞梦芹，周 冰，李焕娟，周德刚
(洛阳惠中兽药有限公司,河南洛阳 471000)
头孢泊肟酯是日本三共公司开发的第三代口服头孢菌素，为头孢泊肟的前体药物，1990年首次在日本上市，其口服后在肠壁被非特异性酯酶水解为头孢泊肟经肠道吸收[1-2]。头孢泊肟抗菌作用广谱，其具有组织分布广泛，对β内酰胺酶稳定，耐受性良好，治疗剂量小等优点，临床上主要用敏感菌引起的上、下呼吸道感染、皮肤和软组织感染、生殖泌尿系统感染、儿科感染[3-5]。在兽医临床领域，2004年硕腾公司开发的头孢泊肟酯片(商品名：SIMPLICEF®)经美国食品药品监督管理局批准上市，用于治疗犬由金黄色葡萄球菌等敏感菌引起的皮肤感染，2014年头孢泊肟酯咀嚼片在美国批准上市。为满足国内宠物临床用药需求，洛阳惠中兽药有限公司仿制开发了头孢泊肟酯片，并通过与参比制剂在多种溶出介质中溶出行为比较，评价自制产品与参比制剂体外溶出的一致性，以期控制并提高自制产品的质量，提高生物等效性试验的成功率。
1.1 仪器与试剂 RC1207DP-RZQ12D型溶出试验仪(配取样收集系统)，天津市天大天发科技有限公司；
UV2100型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；
AB265-S电子分析天平，梅特勒托利多公司；
Seven easy型酸度计，梅特勒托利多公司。冰醋酸、盐酸、甘氨酸、氯化钠、醋酸钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠均为分析纯；
甲醇为色谱纯；
水为纯化水。
1.2 试药 头孢泊肟酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130517-201503，含量：以头孢泊肟计73.4%)；
SIMPLICEF®(硕腾公司，批号：JH8427，规格：100 mg)；
自制头孢泊肟酯片(洛阳惠中兽药有限公司，批号：ZS20191101、ZS20191201、ZS20191202，规格：100 mg)。
2.1 溶出介质的配制 盐酸溶液(pH 1.5)：量取盐酸3.73 mL，用水稀释至1000 mL，摇匀，即得。
甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)：取甘氨酸54.5 g和氯化钠42.6 g，置1000 mL量瓶中，加水500 mL溶解，缓缓加入盐酸14.2 mL，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。取贮备液50 mL，加水至900 mL(必要时，用10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至3.0±0.1)。
醋酸盐缓冲液(pH 4.0)：称取醋酸钠1.22 g，用适量水溶解后，加入2 mol/L醋酸溶液20.5 mL，用水稀释至1000 mL，摇匀，即得。
磷酸盐缓冲液(pH 6.8)：量取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 mL，0.2 mol/L氢氧化钠溶液112 mL，用水稀释至1000 mL，摇匀，即得。
2.2 溶出试验方法 取本品，照《中国兽药典》2015年版一部溶出度与释放度测定法(附录0931第二法)[6]，分别在2.1项下的4种溶出介质中开展溶出试验，体积为900 mL，转速为75 r/min，依法操作，分别在5、10、15、30、45、60 min取样10 mL，用0.45 μm滤膜过滤，同时补加同温等体积溶出介质。
取上述过滤后的溶出液，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
另精密称取头孢泊肟酯对照品适量，加甲醇适量溶解并用溶出介质定量稀释制成每1 mL中约含头孢泊肟11 μg的溶液，作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液，照《中国兽药典》2015年版一部紫外-可见分光光度法(附录0401)[6]，分别测定吸光度，计算每个时间点的累积溶出度。盐酸溶液(pH=1.5)、甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH=3.0)、醋酸盐缓冲液(pH=4.0)、磷酸盐缓冲液(pH=6.8)的检测波长分别为262、259、255、253 nm。
根据每个时间点的累积溶出度，绘制溶出曲线，计算自制产品与参比制剂溶出曲线相似因子(f2)。
2.3 方法学验证
2.3.1 检测波长的选择 称取头孢泊肟酯对照品约30 mg，置200 mL量瓶中，加甲醇2 mL溶解后，用溶出介质稀释至刻度，制成浓度为0.11 mg/mL的溶液，作为对照品储备液；
精密量取储备液10 mL，置100 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，制成浓度为11 μg/mL的对照品溶液，在190～400 nm范围内进行紫外扫描，结果见表1。
2.3.2 辅料干扰试验 称取空白辅料10.35 mg，置100 mL量瓶中，加溶出介质至近刻度，超声充分溶解后，用溶出介质稀释至刻度，过滤，取续滤液10 mL，置100 mL量瓶，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，在190～400 nm范围内进行紫外扫描，结果见表1。
2.3.3 取样时间点选择 取参比制剂SIMPLICEF®，照2.2项下方法试验，分别于为5、10、15、20、30、45、60 min时取样测定，计算各取样时间点的累积溶出度，结果见表1。
2.3.4 重复性考察 取自制头孢泊肟酯片12片，照2.2项下方法试验，在规定的时间点分别取样测定，计算各取样时间点的累积溶出度，结果见表1。
2.3.5 溶出液稳定性考察 溶出液室温放置，分别在0、0.5、1、2、3、4 h，照2.2项下方法测定吸光度，结果见表1。
2.3.6 滤膜吸附考察 用注射器吸取溶出液10 mL，经聚醚砜微孔滤膜(0.45 μm)过滤，分别弃去前1、2、3、4、5 mL滤液后，收集剩余续滤液；
另取溶出液10 mL，4000转/min离心5 min，取上清液。取各续滤液及上清液，照2.2项下方法测定吸光度，结果见表1。
2.3.7 线性和范围考察 精密量取2.3.1项下制备的对照品储备液1、2、5、10、12 mL，分别置100 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，照2.2项下方法测定吸光度，结果见表1。
2.3.8 回收率考察 分别精密称取头孢泊肟酯适量，再精密加入适量空白辅料，混匀，制成含头孢泊肟相当于标示量的50%、70%、100%的供试品。精密称取供试品适量，置250 mL量瓶中，加入适量溶出介质，超声处理30 min使完全溶解，放冷，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液1 mL，置10 mL量瓶，用溶出介质稀释至刻度，分别制成相当于检测浓度50%、70%、100%的供试品溶液。照2.2项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表1。
表1 溶出曲线测定方法学验证总结Tab 1 Summary of validation of dissolution curve determination methodology
2.4 不同溶出介质中溶出曲线考察 取自制头孢泊肟酯片和参比制剂SIMPLICEF®，照2.2项下方法试验，分别测定样品在4种溶出介质中的溶出曲线，自制头孢泊肟酯片与SIMPLICEF®在盐酸溶液(pH=1.5)中15 min内的累积溶出度均超过85%，在其他3种介质中的相似因子(f2)均大于50，根据《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》，表明3批自制头孢泊肟酯片与参比制剂SIMPLICEF®在4种溶出介质中的溶出行为均相似，结果见图1～图4和表2所示。
表2 自制头孢泊肟酯片与SIMPLICEF®在4种介质中的溶出结果(n=12)Tab 2 Dissolution results of self made cefpodoxime proxetil tablets and simplicef ®in four media (n=12)
图1 自制头孢泊肟酯片与SIMPLICEF®在盐酸溶液(pH 1.5)中的溶出曲线对比Fig 1 self made cefpodoxime proxetil tablets and simplicef ® Comparison of dissolution curves in hydrochloric acid solution (pH 1.5)
图2 自制头孢泊肟酯片与SIMPLICEF®在甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)中的溶出曲线对比Fig 2 self made cefpodoxime proxetil tablets andsimplicef ® Comparison of dissolution curves in Glycine-sodium-chloride hydrochloric acid solution (pH 3.0)
图3 自制头孢泊肟酯片与SIMPLICEF®在醋酸盐缓冲液(pH 4.0)中的溶出曲线对比Fig 3 self made cefpodoxime proxetil tablets and simplicef ® Comparison of dissolution Acetate buffer (pH 4.0)
图4 自制头孢泊肟酯片与SIMPLICEF®在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中的溶出曲线对比Fig 4 self made cefpodoxime proxetil tablets andcurves in simplicef ® Comparison of dissolution curves inPhosphate buffer (pH 6.8)
3.1 不同介质溶出曲线区分力比较 头孢泊肟酯片在《中国药典》2020年版、USP 40版和JP 17版均有收载，JP17版中溶出度测定使用的介质为水，在《中国药典》2020年版和USP 40版中溶出度测定使用的介质为甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)[7-9]。国内学者曾对头孢泊肟酯片的溶出度方法进行研究[10-11]，分别以0.1 mol/L盐酸溶液(pH 1.2)、甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)和水为溶出介质对国内样品的溶出度进行检测，结果发现以甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)和水为溶出介质时溶出曲线有较好的区分力，以甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)为溶出介质更为合理。
3.2 溶出介质的选择依据 根据FDA文件公开的Putney公司犬用头孢泊肟酯片研究资料，除了以甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)为溶出介质进行溶出曲线的考察之外，也采用了甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 1.5)、甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.5)、甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 6.8)进行溶出曲线的考察。根据《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》，选择与FDA公开资料中pH值相近的溶出介质进行溶出曲线的考察，溶出介质分别为：盐酸溶液(pH值1.5)、甘氨酸-氯化钠-盐酸溶液(pH 3.0)、醋酸盐缓冲溶液(pH值4.0)、磷酸盐缓冲溶液(pH值6.8)。
体外溶出试验是评价口服固体制剂质量的重要方法之一，其与制剂的生物利用度存在很大的关联性[12]。普通口服固体制剂，可采用比较仿制制剂与参比制剂体外多条溶出曲线相似性的方法，评价仿制制剂的质量，该法可降低两者出现临床疗效差异的风险。本研究通过比较自制头孢泊肟酯片与参比制剂SIMPLICEF®在多种pH值溶出介质中的溶出行为，评价其体外溶出一致性，结果显示，在各种介质中两者的溶出曲线均相似，表明自制头孢泊肟酯片与参比制剂SIMPLICEF®的溶出行为基本一致，为其体内生物等效性评价奠定基础。
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