刘景珍 李彦华 葛一蓉 薛红娟 刘文春
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML），类似于大多数其他人类恶性肿瘤，是一种高度异质性疾病[1]。约40%的年轻AML 患者和10%的老年AML患者可以通过目前的标准化疗治愈[2]。尽管近年来AML 治疗取得了一些进展，但由于耐药性的快速发展和治疗后的高复发率，AML 患者的长期生存仍很差[3]。因此，寻找针对AML 的特异性、新颖的治疗靶点越来越迫切，这可能会改善AML 的临床疗效。一些报道认为长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是AML 进展中的新调节因子。lncRNA 由RNA 聚合酶Ⅱ转录，其5"端可被帽封，3"端可聚腺苷化[4]。lncRNA 的失调参与了癌症的发生和进展[5-6]。lncRNA 通过多种机制调控癌细胞中与增殖、生存、迁移、转移或多能性相关的下游基因的表达[7]。诸多临床试验[8-9]表明，lncRNA 作为新型肿瘤相关生物标志物在早期肿瘤筛查和预测肿瘤患者临床结果方面具有重要的潜力。然而，lncRNA 在AML 中的表达和功能研究还很有限。LINC01234 是近年来新发现的与肿瘤进展相关的lncRNA，位于染色体12q24.13 上。部分研究表明，LINC01234 在乳腺癌[10]、肝癌[11]、结直肠癌[12]中上调表达，能够促进疾病进展。上述研究表明，LINC01234 在人类疾病进展中作用重大。然而，LINC01234 在AML 中的表达及其与AML 细胞进展之间的相关性尚未明确。因此，本研究将揭示LINC0-1234 在AML 中的表达情况，并探讨LINC01234 在AML 中的功能及潜在机制。
1.1 临床资料
分析2019 年3 月至2021 年9 月在湖北省恩施州中心医院确诊的31 例AML 患者和在本院体检的24 例健康志愿者的外周血标本。31 例AML 患者中男性20 例，女性11 例，平均年龄（49.34±12.29）个月。根据FAB 分型，31 例AML 患者中M1 型8 例，M2型11 例，M4 型8 例，M5 型4 例。24 例健康志愿者中男性14 例，女性10 例，平均年龄（36.59±5.42）个月。采集的外周血标本用标准Ficoll-Hypaque 密度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）。所有受试者均已成年且均签署知情同意书，相关研究经本医院人类伦理委员会批准，并根据《赫尔辛基宣言》进行。
HS-5（人骨髓基质细胞）及AML 细胞株（MV-4-11、NB4、KG-1、THP-1、HL-60）购自浙江美森细胞科技有限公司。细胞在RPMI1640 培养基（10%胎牛血清）中，37℃和5%CO2培养。
1.2 方法
1.2.1 试剂和仪器 shRNA 阴性对照（sh-control）、LINC01234 shRNA（sh-LINC01234）、LINC01234 过表达质粒（LINC01234）和其对照组、胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白1（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）shRNA（sh-IGF2BP1）、IGF2BP1/c-Myc 过表达质粒（pcDNA-IGF2BP1/pcDNA-c-Myc）和其对照（pcDNA-control）由上海吉玛制药技术有限公司合成。兔抗IGF2BP1、兔抗c-Myc、兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG（HRP）购自美国Abcam 公司。Lipofectamine3000转染试剂购自中国赛默飞公司，TRIzol 试剂购自北京雷根生物公司，反转录试剂盒购自大连宝生物公司，SYBR Green qPCR 试剂盒购自北京毕特博生物公司，CCK-8 试剂盒购自上海吉满生物科技公司，EZ-Magna RIP 试剂盒购自上海玉博生物公司，RIPA 缓冲液购自北京百奥莱博公司，SuperSignal West Femto 试剂盒购自赛默飞世尔科技公司。ABI StepOnePlus 实时定量PCR 系统购自Applied Biosystems 公司，显微镜购自上海通灏光电科技有限公司。
1.2.2 细胞转染和分组 为研究LINC01234 对AML细胞增殖、迁移、侵袭的影响，本研究使用Lipofectamine3000转染试剂对HL-60 细胞进行转染，并分为空白对照组（BC 组，正常培养）、sh-control 组（转染shRNA 阴性对照）、sh-LINC01234 组（转染LINC-01234 shRNA）；
为探究LINC01234 调控AML 细胞增殖、迁移、侵袭的作用机制，本研究在sh-LINC-01234 组的基础上，分别转染c-Myc 过表达质粒或阴性对照，并记为sh-LINC01234+pcDNA-control 组、sh-LINC01234+pcDNA-c-Myc 组。
1.2.3 实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qRTPCR）根据制造商的说明，用TRIzol 试剂从细胞或组织中提取总RNA。应用反转录试剂盒合成cDNA。然后根据试剂盒协议使用SYBR Green qPCR 试剂盒对cDNA 进行qPCR 检测。基于阈值循环（Ct）定义lncRNA、基因的表达水平，并采用2-ΔΔCt法计算。以GAPDH 作为lncRNA、基因的参考。引物序列如下：LINC01234：F 5"-TCACCTCCTCGGTCTCAGTT-3"，R 5"-GGGTGAGAAGAGACAAGCGT-3"；
IGF2BP1：F 5"-GGTTAGGCCTCTCCTCCTAATA-3"，R 5"-CCTT CCCAGCACACTTGATAG-3"；
c-Myc：F 5"-AAGCTG AGGCACACAAAGA-3"，R 5"-GCTTGGACAGGTTA GGAGTAAA-3"；
GLI1：F 5"-AGCTAGAGTCCAGAG GTTCAA-3"，R 5"-TAGACAGAGGTTGGGAGGTAA G-3"；
Slug：F 5"-AACTACAGCGAACTGGACAC-3"，R 5"-GAGGATCTCTGGTTGTGGTATG-3"；
HULC：F 5"-GGAACTCTGATCGTGGACATT-3"，R 5"-ATTCCG GCCTTTACTTCAGAG-3"；
GAPDH：F 5"-GGTGTGA ACCATGAGAAGTATGA-3"，R 5"-GAGTCCTTCCA CGATACCAAAG-3"。
1.2.4 细胞增殖检测 采用CCK-8 试剂盒检测细胞增殖情况。HL-60 细胞置于96 孔板中（每孔1 000 个细胞）。在指定时间点（培养24、48、72、96 h）加入CCK-8 试剂（15 μL/孔）。在5%CO2中37℃孵育2.5 h后，在酶标仪上450 nm 处测量吸光度（OD）。
1.2.5 Transwell 侵袭和迁移实验 将250 μL 培养基中的经过处理的HL-60 细胞置于预先涂上Matrigel 的上腔中（1×105个细胞/孔）。对于transwell 迁移检测，上腔室不需要预先涂上Matrigel。下室添加含15%胎牛血清的培养基。培养24 h 后，移出培养基，用70%乙醇和0.1%结晶紫处理细胞。PBS 洗涤2次后，用显微镜拍摄侵袭或迁移细胞的图像。
1.2.6 RNA 免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）反应 根据制造商的说明，使用EZ-Magna RIP试剂盒与IGF2BP1 抗体或免疫球蛋白G（IgG）进行RIP，IgG 作为对照。
1.2.7 RNA pull-down 实验 将LINC01234 或反义LINC01234（antisense LINC01234）cDNA 克隆到pBluescriptⅡ载体中。生物素标记RNA 在体外转录和纯化。将细胞提取液与生物素化RNA 混合，再与预洗的链霉亲和素-琼脂糖小珠混合1 h。小珠短时间洗涤5 次，在十二烷基硫酸钠缓冲液中煮沸，提取的蛋白通过Western blot 或质谱分析进行检测。antisense LINC01234 为阴性对照。
1.2.8 放线菌素D 处理检测 c-Myc RNA 的稳定性采用放线菌素D 检测。将2 mg/mL 放线菌素D 添加到经1.2.2 处理后的HL-60 细胞中，分别培养0、4、8、12、16 h。
1.2.9 Western blot 分析 细胞在RIPA 缓冲液中裂解获得全蛋白。然后定量测定整个蛋白质，在十二烷基硫酸钠缓冲液中煮沸。利用SDS-PAGE 凝胶分离蛋白，然后将分离的蛋白转移到PVDF 膜上。用一抗在4℃孵育膜过夜，用含Tween 20 的磷酸盐缓冲盐水冲洗膜后，用相应的二抗在室温下孵育膜2 h。最后，采用SuperSignal West Femto 试剂盒将膜蛋白带可视化。一抗、二抗分别为：兔抗IGF2BP1、兔抗c-Myc、兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG（HRP）。GAPDH作为内源性对照。
1.3 统计学分析
采用GraphPad Prism6.0 软件进行统计学分析。数据以±s表示。统计方法主要包括双尾t检验和方差分析（ANOVA）。Tukey 的事后检验被用于检验组间数据的差异。以P<0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 LINC01234 在AML 中高表达
如图1A 显示，与健康志愿者PBMC 样本相比，AML 患者PBMC 样本中LINC01234 水平明显升高（P<0.05）。此外，图1B 显示，与HS-5 细胞相比，LINC-01234 在5 个AML 细胞中表达明显上调（P<0.05）。选择LINC01234 水平最高的HL-60 细胞进行后续实验。
图1 AML 标本及细胞系中LINC01234 表达
2.2 沉默LINC01234 可抑制AML 细胞的增殖和迁移
与BC 组和sh-control 组比较，sh-LINC01234 组LINC01234 的水平显著降低，OD450（48、72、96 h）值显著降低，侵袭和迁移数目明减少（P<0.05），见图2。
图2 沉默LINC01234 对AML 细胞的增殖和迁移的影响
2.3 LINC01234 与IGF2BP1 相互作用
Starbase 数据库显示IGF2BP1 可能与LINC01-234 相互作用。RNA pull-down 实验证实了LINC012-34 和IGF2BP1 之间的相互作用（图3A）。RIP 实验结果显示IGF2BP1 和LINC01234 之间存在显著的相关性（图3B）。然而，在HL-60 细胞中，sh-IGF2BP1组IGF2BP1 mRNA 和蛋白水平显著降低（P<0.05），LINC01234 的水平基本不变（P>0.05），见图3C。图3D显示，过表达或下调LINC01234 不影响IGF2BP1 蛋白的表达（P>0.05）。
图3 LINC01234 与IGF2BP1 相互作用
2.4 LINC01234 通过竞争性结合IGF2BP1 促进c-Myc mRNA 的稳定性
qRT-PCR 结果显示，sh-LINC01234 组HL-60 细胞中c-Myc mRNA 水平显著降低（P<0.05），GLI1、Slug、HULC mRNA 的表达无显著性差异（P>0.05），见图4A。图4B 显示，放线菌素D 处理后sh-LINC 01234 组c-Myc mRNA 的半衰期显著缩短（P<0.05）。使用IGF2BP1 抗体进行RIP 实验，结果显示，LINC01-234 组IGF2BP1 与c-Myc mRNA 的相互作用升高，sh-LINC01234 组IGF2BP1 与c-Myc mRNA 的相互作用降低（P<0.05），见图4C。与sh-LINC01234 组和sh-LINC01234+pcDNA-control 组相比，sh-LINC012-34+pcDNA-IGF2BP1 组IGF2BP1、c-Myc 表达明显升高，c-Myc mRNA 的稳定性增强（P<0.05），见图4D～F。
图4 LINC01234 通过竞争性结合IGF2BP1 促进c-Myc mRNA 的稳定性
2.5 LINC01234 通过调节c-Myc 的表达在AML 细胞中发挥作用
与sh-LINC01234 组和sh-LINC01234+pcDNAcontrol 组比较，sh-LINC01234+pcDNA-c-Myc 组c-Myc 表达明显升高，OD450（48、72、96 h）值显著增高，侵袭和迁移数目明显增多（P<0.05），见图5。
图5 LINC01234 通过调节c-Myc 的表达影响AML 增殖、侵袭和迁移
AML 是一种异质性恶性肿瘤，干细胞研究和大量的基因组分析均取得了显著进展，极大地促进AML 发病机制中潜在分子机制的研究[13-14]。然而，治疗效果是有限的。因此，亟需发现新的抑制AML 细胞增殖转移的靶点，以改善AML 患者的临床预后。lncRNA 的异常表达已在多种类型的癌症中被描述，其在AML 发病机制中的功能仍在不断被阐明。本研究探索了LINC01234 在人类AML 细胞中的潜在作用，结果发现慢病毒介导的LINC01234 干扰可以有效抑制AML 细胞的增殖、侵袭和迁移，这依赖于竞争性结合IGF2BP1 降低c-Myc 的表达。因此，本研究在人类AML 发病机制中发现了一个LINC01234-IGF-2BP1-c-Myc 轴，其可能被用作AML 诊断和治疗的生物标志物。
本研究发现，LINC01234 在AML 患者和人AML细胞系中均有高表达，说明LINC01234 可能促进AML 发展。LINC01234 的表达也被一致地发现与乳腺癌的进展有关。在配对的临床样本中，乳腺癌组织中LINC01234 相对于相邻正常组织表达上调，其下调显著抑制MDA-MB-231 和MDA-MB-468 细胞的增殖和迁移[15]。同样，在本研究中，人类AML 细胞中的LINC01234 也具有促增殖功能，其沉默显著抑制了HL-60 细胞的增殖和转移能力。上述结果表明，LINC01234 在AML 致癌过程中起到启动子的作用。此前，Liu 等[16]报道了LINC01234 在口腔鳞状细胞癌中高表达。在其体外实验中，LINC01234 被证明通过调节miR-433-3p/PAK4 显著促进肿瘤细胞的增殖和转移。其结果与本研究的发现相一致，提示LINC01-234 的功能在不同类型的肿瘤中是相似的。
IGF2BP1 与胚胎发生和癌变有关。IGF2BP1 作为一种转录后因子，调控癌细胞增殖、侵袭和耐药所需的一些重要mRNA 靶标的表达，与各种类型的人类癌症中较差的总生存率有关。IGF2BP1 是一种RNA结合蛋白，已报道与c-Myc、GLI1、Slug 和HULC RNA 相关，并在癌细胞中获得稳定[17-20]。本研究通过Starbase 数据库预测到LINC01234 可能与IGF2BP1存在互作。在这里，RNA pull-down 和RIP 分析证明了LINC01234 和IGF2BP1 之间的相互作用。然而，IGF2BP1 的表达不受LINC01234 的调控。近期，一些lncRNA 被报道与IGF2BP1 相关。LINC01093 特异性地直接结合IGF2BP1，干扰IGF2BP1 与GLI1 mRNA 的相互作用，诱导其在HCC 中降解[18]。在视网膜母细胞瘤中lncRNA THOR 通过增强IGF2BP1蛋白和c-Myc mRNA 的结合上调c-Myc 的表达[21]。因此，本研究检测了LINC01234 是否影响IGF2BP1靶标的表达，发现仅有c-Myc 可以被LINC01234 正调控。c-Myc 的异常表达是大多数恶性肿瘤过度增殖的一个标志，也是哺乳动物细胞中引起程序性细胞死亡-凋亡的一种强有力的因子[22]。c-Myc 的表达在许多水平上受到调控，并在很大程度上受到转录后调控机制的控制。在转录后控制c-Myc 表达的因素中，癌胚RNA 结合蛋白IGF2BP1 保护CRD 序列不被切割，稳定mRNA 并增加其表达[23-24]。此外，LINC-01234 促进了IGF2BP1 与c-Myc mRNA 的结合，促进了c-Myc mRNA 的稳定性。本研究表明，LINC0-1234 与IGF2BP1 相关，抑制了c-Myc mRNA 的衰减，从而促进了AML 的生长和转移。与本研究一致的是，Chen 等[25]发现LINC01234 与c-Myc 表达显著正相关，在肺癌中LINC01234 通过与HNRNPA2B1 相互作用调控miR-106b-5p/CRY2 轴，进而增加c-Myc 的表达。
综上所述，本研究首次发现LINC01234 在AML中高表达。LINC01234 通过与IGF2BP1 竞争性结合被发现是癌蛋白c-Myc 的促进因子，可能通过竞争性结合IGF2BP1 促进c-Myc mRNA 的稳定性，提示LINC01234 在AML 治疗方面可能是一种有效的治疗方法。
本文无影响其科学性与可信度的利益冲突。
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