杨艳红，张浩铂，姚心怡，贺 禧，王 哲
1重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054；
2重庆市育才中学，重庆 400050
近年来，随着石化燃料的无限使用，全球油价剧烈波动，严重影响人类的日常生活[1]。人们越来越关注新的替代能源的研究和开发，纤维素生物质燃料是目前公认的最具生产价值和发展前景的可再生能源[2]。纤维素生物质是地球上分布最广、含量最丰富的生物质，主要由纤维素、半纤维素，木质素组成[3]。但纤维素、半纤维素和木质素是通过氢和共价键紧密结合，具有顽固性生物质结构，我们仅开发了不到2%的纤维素资源[4,5]。利用现代生物技术将纤维素转化为乙醇等液体燃料，产量稳定、可再生和无污染，有希望解决能源危机、环境污染和粮食危机等问题[6]。但要解决这一问题，最关键的是要获得高效、低廉的纤维素酶。
纤维素酶(cellulase)是降解纤维素生成单糖或多糖的一组复合酶系的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶，3种酶相互协同降解纤维素物质[7]。目前，对纤维素酶产生菌的研究主要集中在真菌如木霉属、青霉属和曲霉属等，而其纤维素酶多数结合在细胞膜上，使用很不方便，且酶的分离提取成本太高。并且真菌纤维素酶不仅生产周期长，产生的纤维素酶大多也要在较高温度条件下才能发挥较好的效能，室温或较低温度下，酶活力都非常低[8]。细菌相对于真菌生长速度快，能获得更高表达量的重组酶，能生产更复杂的糖苷水解酶系进行酶解协同反应。同时，细菌具有极高的自然多样性，更有可能产生耐热的、碱稳定性酶等[9,10]。到现在为止，研究较多的产纤维素酶的细菌有：弧菌、芽孢杆菌、拟杆菌、纤维素单胞菌、梭状芽孢杆菌、欧文氏菌、瘤胃球菌和热单胞菌[11]。
目前为止，虽然已经做了大量的木质纤维素的转化研究，但是由于半纤维素酶和纤维素酶的商业成本非常高，把纤维素生物质转化成生物乙醇仍面临巨大挑战[12]。因此，开发新型、高效、低成本的纤维素酶迫在眉睫，选育纤维素酶高产菌株尤其重要[13]。从实验室保存菌株中筛选出纤维素酶高产细菌菌株，对其进行鉴定研究，为纤维素酶制剂研究提供菌株来源和为遗传改良、基因工程菌株的构建等工作奠定一定基础。
1.1 材料
42株菌株为重庆理工大学药学与生物工程学院发酵工程实验室保存；
葡萄糖、刚果红等常规试剂均为国产分析纯。其他主要试剂包括：DNA 提取试剂盒、1×TSE101金牌mix、TSINGKE高纯度低电渗琼脂糖、DNA 凝胶回收试剂盒(北京擎科生物科技有限公司，货号分别为：TSP101-200；
1×TSE101；
TSJ001；
TSP601-50)。
主要仪器设备：HS-1300U水平双人单面净化工作台(上海苏净有限公司)；
ZQZY-88CES全温振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)；
WFZ UV-2100紫外分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；
GI54DWS立式压力蒸汽灭菌器(美国ZEALWAY)；
GL10MD大容量高速离心机(湘仪离心机有限公司)；
3730XL测序仪(美国Applied Biosystems)；
Legend Micro17离心机(美国Thermo)；
2720 thermal cycler PCR仪(美国Applied Biosystems)；
JY300 C电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；
JY04S-3C凝胶成像仪(北京君意东方电泳设备有限公司)。
筛选培养基：CMC-Na 0.4 g、NH4NO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、NaCl 1.0 g、CaCl20.1 g、FeCl30.02 g、酵母膏 0.05 g、水100 mL，pH 7.0～7.2。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏：0.3 g，蛋白胨：1.0 g，NaCl：0.5 g，蒸馏水100 mL，pH 7.0。菌种鉴定培养基：参见《常见细菌系统鉴定手册》[14]。
1.2 方法
1.2.1 初筛
把各个菌株点种于筛选培养基平板，30 ℃培养 3 d，用0.1%刚果红试剂染色，5 min后用1 mol/L NaCl溶液脱色。挑选菌落周围出现清晰的透明水解圈的菌株继续进行纯化与复筛。
1.2.2 纯化与复筛
1.2.3 菌株形态与染色及菌落形态观察
将复筛出的分离菌株划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板，置30 ℃培养 1～2 d，参照《现代微生物学实验技术》[15]，观察分离菌株菌体形态与其他特征。
1.2.4 生理生化特征
参照文献《常见细菌系统鉴定手册》[14]和《现代微生物学实验技术》[15]进行。
1.2.5 16S rDNA序列测定
把各个菌株培养至对数期，严格按照DNA提取试剂盒操作，获得基因组DNA，DNA样品适量稀释后作为PCR模板进行PCR反应，DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。纯化产物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行全序列测序。序列通过NCBI网站中的BLAST程序与GenBank中的核酸数据进行比对分析。根据比对结果，从数据库中选取与所分析的细菌基因序列同源性较高的已知相关序列，采用MEGA 11.0软件进行多重序列比对分析，用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树。
1.2.6 AF1菌固体发酵培养基筛选
活力定义：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH 6.0，45 ℃，恒温30 min)下，以水解反应中，1 g发酵固体产生的纤维素酶1 min催化纤维素生成1 μg葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
滤纸酶活力测定方法：采用DNS法[14]。
对上述筛选到产酶活力最大的AF1菌株的固体发酵培养基进行优化筛选。先预实验确定最佳纤维素粉为玉米秸秆粉，最佳迟效氮源蛋白胨和麸皮。在此基础上对培养基的主要成分进行13因素3水平的正交实验优化，固体发酵从第1 d开始取样，每24 h取一次样，直到测定滤纸酶活下降为止，以最高滤纸酶活为指标进行直观分析和方差分析。
1.2.7 AF1菌理化因素发酵条件筛选
先经预实验初步确定发酵条件为pH 6.5，温度35 ℃。然后以pH、温度和接种量为考察因素进行进一步正交优化，取样检测具体方法同“1.2.6”。以最高滤纸酶活为指标进行直观分析。
2.1 初筛和复筛
42株菌株点种于筛选培养基初筛，发现有16个菌落周围有明显水解圈。初筛菌株纯化和产酶复筛后，根据水解圈直径与菌落直径之比，筛选出5株相对酶活较高的菌株(水解圈直径/菌落直径≥4.5)。本实验室为了菌株管理方便，根据菌株分离的样品来源地或者菌株特性对5株菌分别进行编号为：B4、AF1、RC1、B1和ZB6。其中AF1菌株的活性最高(水解圈直径/菌落直径=8.04)，见表1和图1。菌株B4分离自重庆南川区含有很多落叶的水塘淤泥；
菌株ZB6分离自重庆南川一饲喂红薯藤等杂食养猪场的猪粪；
菌株AF1分离自实验室PDA平板上；
RC1分离自重庆市荣昌养猪场的猪粪、B1分离自重庆理工大学食堂餐厨垃圾。
表1 5株产纤维素酶细菌水解圈与菌落直径比较Table 1 Hydrolysis circle and colony diameter of five strains producing cellulase
图1 产酶细菌的平板复筛实验Fig.1 Plate screening test of cellulase-producing strains
2.2 菌落形态及个体形态
复筛分离的5株菌株菌落均呈圆形，乳白色，大小不等，多数中心隆起，边缘有的整齐、有的呈锯齿状、有的不规则，表面有的湿润且黏稠、有的表面干燥且有皱褶(见图2)。菌体革兰氏染色均为阳性，均为杆状，有的长杆状、有的短杆状，均有芽孢中生，芽孢不大于菌体横径，各菌体形态特征具体见表2。
图2 5株复筛菌株的菌落形态Fig.2 Colony morphology of five rescreening strains
表2 5株复筛菌株的菌落形态和菌体特征Table 2 Colony morphology and cell characteristics of five rescreening strains
2.3 生理生化特征
复筛出的5株菌株的生理生化特征试验结果见表3。常规项目中，5株菌株除了运动性、V-P试验存在差别，其他项目都相同，且相同的项目中只有吲哚实验呈阴性，其余项目全部呈阳性。糖利用试验结果发现：这5株菌株除了B4菌株对木糖利用能力一般，其余菌株对五碳糖木糖和阿拉伯糖的利用能力都非常好，由此推测：这几株分解纤维素的菌株之所以对五碳糖木糖和阿拉伯糖有利用偏好，这是因为五碳糖木糖和阿拉伯糖是组成半纤维素的重要单糖，而半纤维素又像粘合剂一样附着在纤维素上对其起保护作用[16]。而这些菌株为了利用纤维素，则先产生半纤维素酶分解利用半纤维素，破坏保护纤维素的外壳，使得纤维素可以更多地暴露出来，然后再产生纤维素酶进一步分解纤维素。对于六碳单糖，5株菌株对葡萄糖、果糖和半乳糖都能利用或者较好地利用；
对于二糖，除了RC1不能利用蔗糖而外，其他菌株对蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖都能利用或者较好地利用；
对于淀粉，五株菌株都能利用，其中RC1对淀粉利用最好。
表3 5株复筛菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of five rescreening strains
续表3(Continued Tab.3)
综合5株菌株的形态特征及生理生化特性，《常见细菌系统鉴定手册》[14]中相应属、种的有关性状，可将五株菌株全部归入芽孢杆菌属(Bacillus)。
2.4 菌株 16S rDNA 鉴定结果
以各菌株的总DNA为模板，用16S rDNA通用引物进行PCR扩增各个菌株16S rDNA片段，得到5个菌株的DNA片段分别为：B1(1 451 bp)、B4(1 449 bp)、AF1(1 475 bp)、RC1(1 450 bp)和ZB6(1 449 bp)。它们在GenBank中的登录号分别为：OM756734、OM755768、KM373520、OM756735和OM756736。
经各菌株16S rDNA序列在GenBank中作同源性检索分析，5株分离菌16S rDNA序列与GenBank 中已注册参考菌株的16S rDNA序列同源性均高于99.5%，从中选取部分同源性较高的菌种，用MEGA11.0构建的系统发育树(见图3)，分析发现：菌株B4、AF1和RC1是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，B1和 ZB6是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
图3 5株菌的16S rDNA全序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequence of five strains注：步长值为1 000，节点上的频率大于50%的保留，括号中的数字表示序列在GenBank中的登录号。Note:Bootstrap percentage values (>50%) based on 1 000 tree replications are indicated at the branching points.The numbers in parentheses represent the sequence′s login number in GenBank.
2.5 AF1菌固体发酵培养基筛选
培养基筛选的正交试验结果如表4所示。由极差值R可以得出各因素对菌株AF1产酶活力的影响程度由大到小依次为：水> NaCl >CaCl2> 玉米秸秆粉>麸皮>吐温80>MgSO4·7H2O >(NH4)2SO4>KH2PO4>蛋白胨>糖蜜>吐温20。由正交分析得出AF1菌的固体发酵培养基最佳配比为：玉米秸秆粉20 g水125 mL，NaCl 0.4 g，CaCl20.2 g，麸皮32 g，吐温80 0.2 g，蛋白胨0.7 g ，(NH4)2SO40.8 g ，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，糖蜜0.4 g，吐温20 0.4 g。
表4 AF1菌发酵培养基成分正交实验结果Table 4 Results of orthogonal test on medium components of AF1 strain
续表4(Continued Tab.4)
根据表5方差分析进行因素显著性判断可见，玉米秸秆粉、NaCl、CaCl2和水对AF1菌滤纸酶活有非常显著影响。在上述正交优化结果中，玉米秸秆粉和NaCl的最优水平在中间水平，可以不做筛选；
而水和CaCl2的最优水平则处于边缘水平即皆为第一水平，可以在第一水平附近进一步设置不同梯度做进一步筛选。同时为了验证正交实验结果的可靠性，选择正交实验结果表4中最好的6号实验和优化方案做对比，进行验证实验，补充实验设计及结果见表6。
表5 发酵培养基成分正交实验方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test on medium components
根据表6可以看出，正交优化结果可靠，最优发酵培养基方案为3号，即：玉米秸秆粉20 g，水115 mL，NaCl 0.4 g，CaCl20.2 g，麸皮32 g，吐温80 0.2 g，蛋白胨0.7 g，(NH4)2SO40.8 g ，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，糖蜜0.4 g ，吐温20 0.4 g，酶活最高可达到26.52 U/g。
表6 正交补充实验结果Table 6 Results of supplement tests
2.6 AF1菌理化因素发酵筛选
发酵理化条件筛选采用正交试验，结果见表7，由极差值R可以得出各因素对产酶活力影响由大到小依次为：pH >温度 >接种量。同时，正交分析得出AF1菌的固体发酵条件为：温度30 °C，pH 6.5，接种量1.5%(OD600=1.0)。
表7 理化条件筛选结果Table 7 Results of orthogonal tests on physical and chemical factors
AF1菌在上述确定的最佳培养基和最佳理化条件下进行发酵，做三个平行组，取不同发酵时间的样品测定滤纸酶活，并取平均酶活，做酶活随发酵时间的变化曲线，确定最佳发酵时间，结果如图4所示：在前36 h内滤纸酶活随发酵时间缓慢上升，36 h至42 h之间，滤纸酶活迅速增加，到42 h到达26.904U/g，42 h以后滤纸酶活迅速下降。
图4 酶活随发酵时间的变化曲线Fig.4 Curve of enzyme activity with fermentation time
本研究从实验室保存菌株中共筛选出5株高产纤维素酶的细菌，经形态、生理生化特征和16S rDNA分析鉴定，均为芽孢杆菌属，2 株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，3株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。自然界中许多真菌和细菌都能产生多种纤维素酶。目前，对真菌纤维素酶的研究比较多，市场上的纤维素酶也主要来源于真菌。产纤维素酶细菌也由于其很强的适应性和其他优点而引起极度关注，它们很可能成为工业上非常重要的纤维素酶来源。其中芽孢杆菌能产生和分泌大量胞外酶而成为研究的主要细菌，此外，它们还能在纤维素基质生长缓慢的条件下形成内生孢子和次级代谢产物使得它们占据竞争优势，其中枯草芽孢杆菌又是报道最多的纤维素酶优良产生菌[17]，解淀粉芽孢杆菌鲜有报道。
本文在刚果红-CMC平板上其水解圈直径与菌落直径比值均大于4.5，最小的ZB6为4.61，最大AF1菌的比值达到了8.04，远远超过现有国内外文献报道的用相同方法筛选出的高酶活细菌菌株[9,18-21]。其中文献报道最大酶活是Tang等[21]从长足大竹象的肠道分离出一株菌株PX19，其最高酶活菌株的水解圈直径与菌落直径比值也只有4.83。通过对AF1菌的产纤维素酶固体发酵条件优化筛选后，其最高滤纸酶活可以达到26.904 U/g。除此之外，经前期研究团队研究发现，AF1菌还能产生高活性的淀粉酶、蛋白酶和广谱抗菌活性物质，用于雏鸡饲喂能显著提高饲料转化率，抑制病原菌生长，减少疾病发生，降低死亡率，是一株具有多功能的强大菌株[22-25]，具有很大开发潜能。
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