＊刘玉坤 刘凌雯 孔晶 费玉清 徐林 陈正件
（珠海中科先进技术研究院有限公司 广东 519000）
南极海茸（Durvillaea antarctica）是一种可食用的大型褐藻，对生长环境要求十分严苛，主要分布在南极洲、智利南海沿岸未经任何污染的海域中。其富含膳食纤维、维生素、矿物质、多糖等生物活性成分，具有良好的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化活性，预防肥胖和大肠癌等功效。因此，其在食品、医药以及化妆品行业中具有广泛的应用。
近些年，天然低共熔溶剂（NADES）作为绿色、环保、无毒且高效溶剂，广泛应用在生物和化学领域，包括无机材料的制备、有机合成、生物提取和分析化学等方向。一般情况下，NADES由两种天然成分组成，一种作为氢键受体（HBA），比如季铵盐、胆碱和磷酸盐等；
另一种作为氢键供体（HBD），通常是基于天然植物的有机物，例如,氨基酸、羧酸和糖等。此外，NADES的制备也特别简单，可以通过对混合物加热的方式制备而成。由于氢键的相互作用，使得NADES可以和水混溶，具有低于任一组分的熔点和较高的黏度，并且可以有效地从植物中提取极性和非极性的天然产物，如药物、香料、天然色素等。
基于上面表述的原因，本次实验建立了一种环境友好型的提取方法，利用9种NADES作为提取剂萃取海茸的多酚和多糖，为更有利于开发利用海茸提供了理论数据依据。
(1)材料与仪器
海茸丝干货（山东海洋食品有限公司）；
左旋肉碱（美国Ark Pharm公司）；
顺丁烯二酸、柠檬酸、苯酚、苹果酸、酒石酸、丙二酸、丙酸、脯氨酸、草酸、葡萄糖、丁二酸、过硫酸钾、Vc（国药集团化学试剂有限公司）；
无水碳酸钠（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；
Folin-Ciocalteu试剂（GOLD WHEAT）；
没食子酸（上海泰坦科技股份有限公司）；
浓硫酸（上海穗试公司）。
Master-Q 15去离子纯水机（上海和泰仪器有限公司）；
H1850台式离心机（湖南湘仪离心机有限公司）；
KQ-300E型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；
SynergyHTX多功能酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。
(2)实验方法
NADES的制备
将左旋肉碱与氢键供体（顺丁烯二酸、草酸、脯氨酸、苹果酸、丙二酸、丙酸、柠檬酸、丁二酸和酒石酸）按照试验摩尔比1:1混合，加入规定质量的去离子水，在室温下用超声（40kHz，30W）15～30min，直到发生成稳定、透明、均一的NADES溶液。在本文中，选取左旋肉碱作为氢键受体与9种氢键供体合成提取剂，见表1。
表1 低共熔溶剂组成及编号Tab.1 Composition and numbering of NADES
(3)超声辅助提取
将海茸用粉碎机打碎，过100目筛得到海茸粉末样品，用于后续的提取实验。
①多酚的提取
用乙醇作为对照，以料液比1:20（质量/g:体积/mL）将海茸粉分别与9种NADES提取剂（50%含水量）以及对照提取剂装入50mL离心管中，室温下超声（40kHz，30W）30min，1000rpm离心10min，取上清，得到提取液，4℃冰箱保存，待测多酚含量。
②多糖的提取
以去离子水为对照，按照上述的料液比和实验条件进行。离心后收集上清液，向沉淀试液中加入20mL去离子水进行充分洗涤，以1000rpm离心10min，收集试液上清液，再重复洗涤三次，合并之前试验上清液并用去离子水定容至100mL，得到多糖提取液，4℃冰箱保存，待测多糖含量。
(4)含量的测定
①没食子酸标准曲线的绘制及多酚含量测定
准确称取20.0mg没食子酸，用去离子水定容至100mL，得到0.2mg/mL标准溶液。依次取0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL和10.0mL标准溶液用去离子水定容至10mL，摇匀备用。取200μL不同浓度的标准液加入1mL Folin-Ciocalteu（0.25M）试剂，剧烈振荡摇匀后加入lmL 10%碳酸钠溶液，震荡摇匀后，加入2.8mL去离子水，室温避光90min，吸取200μL待测液置于96孔板中，在765nm处测定吸光度。用去离子水作对照，以吸光度、浓度绘制标准曲线。待测样品按照标准曲线的方式进行测定吸光值，通过标曲计算其浓度。
②多糖含量的测定
吸取葡萄糖标准溶液（0.1mg/mL）0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL置于试管中，各加蒸馏水至补足体积2mL，再加6%的苯酚溶液1mL，摇匀，迅速加入5mL浓硫酸，摇匀后放置30min，吸取200μL待测液置于96孔板中，于490nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度与吸光度做标准曲线。待测样品按上述方法进行多糖含量测定，根据标准曲线计算浓度。
(1)NADES对多酚提取量的影响
由于低共熔溶剂具有两亲性，不仅对水溶性多糖有一定的提取效果，还可以提取一些包括多酚在内的极性物质，NADES对海茸多酚的提取如图1所示。
图1 海茸多酚的提取效率Fig.1 Extraction efficiency of polyphenol from Durvillaea antarctica
通过图1可知，作为对照组的乙醇对海茸多酚的提取效率为0.20mg/g，而9种NADES对海茸多酚的提取效率均显著地高于乙醇（P＜0.05）。在所有的NADES中，NADES-6对多酚的提取率为2.29mg/g，是乙醇提取效果的10倍，且显著地高于其他NADES的提取效果（P＜0.05）。由于NADES具有两亲性，可同时与多酚的极性基团和非极性基团具有相互作用力，因此难以简单地将提取效率与NADES的极性相关联。另外研究表明，相比于普通有机溶剂，NADES对植物细胞壁的破坏能力更强，这就导致更多的酚类物质被释放到提取液中，因此，NADES的提取效果要显著地优于乙醇的提取效果。
(2)NADES对多糖物质提取的影响
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖，NADES对海茸多糖的提取率如图2所示。
图2 海茸多糖的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of Polysaccharide from Durvillaea antarctica
从图2中可以看出，水对海茸多糖的提取量为126mg/g，9种NADES对海茸多糖的提取量均高于水的提取效果。其中NADES-6提取的多糖含量显著地高于水提取多糖的量，多糖含量达到231mg/g，是水提取的1.83倍。NADE-7对多糖的提取效率为214mg/g，与NADES-6的差异不显著。因此，两者都可以显著地提高海茸多糖的提取量。这可能是由于NADES具有较高的氢键结合能力以及可以与多糖发生静电相互作用的原因引起的。
采用超声波辅助提取法，利用9种左旋肉碱作为氢键受体的NADES对海茸进行提取，由左旋肉碱和脯氨酸组合形成的NADES-6对多酚的提取率为2.29mg/g，是乙醇提取效果的10倍，且显著地高于其他NADES的提取效果（P＜0.05）。此外，NADES-6提取的多糖含量达到231mg/g，是水提取的1.83倍。
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