杨金英，王倩菲
(西安市人民医院 西安市第四医院新生儿科，陕西 西安 710004)
胎膜早破在我国发病率为6%～16%，是导致孕产妇难产、新生儿感染的主要原因之一，胎膜早破使胎膜的屏障功能减弱，阴道病原菌可沿生殖道上行，侵犯羊膜，诱发羊膜腔感染，其中以组织型绒毛膜羊膜炎(Histological chorioamnionitis,HCA)多见[1]。HCA虽然症状隐匿，但挪威的一项最新研究调查指出[2]，HCA与新生儿不良结局密切相关。HCA可影响子宫收缩，造成胎儿宫内窘迫，可诱发新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)等新生儿脑损伤疾病[3]。近年研究[4]发现，多种炎症因子与HCA的发生机制有关，并参与新生儿不良结局的发生，监测相应的炎症因子变化，对预测HCA及其不良结局有利。基于此，本研究就HCA与HIE的关系及可能的发生机制展开分析，为我国母婴保健工作开拓思路，现报告如下。
1.1 研究对象 收集2020年1月至2021年12月西安市人民医院收治的86例HCA孕产妇的临床资料，并纳入同期入院的86例未发生HCA孕产妇作为对照组。病例纳入标准：符合中华医学会妇产科学分会产科学组2015年制定的胎膜早破诊断标准[5]，且破膜孕周为28～36+6周；
HCA经胎盘组织病理学检查确诊，且符合《妇产科学(第9版)》[6]诊断标准；
孕产妇年龄>20岁；
单胎妊娠；
病理检查等资料完整。排除标准：胎膜早破入院前1周有抗生素或皮质类固醇药物使用史；
入院后急产；
胎位异常、胎儿结构或染色体异常、死胎；
存在急慢性感染性疾病或不明原因发热；
合并糖尿病、高血压、子宫畸形等早产高危因素。本研究标本及病例资料的收集等均获得患者知情同意，且得到西安市人民医院医学伦理委员会核查及审批。
1.2 研究方法 所有孕产妇在胎盘娩出后取胎膜破口处胎膜组织2 cm×2 cm，0.9%氯化钠溶液冲洗干净后保存于-80 ℃冰箱内；
取冰冻胎膜组织研磨均匀，使用Trizol试剂盒提取总核糖核酸(RNA)，经逆转录试剂盒逆转录，采用实时荧光免疫聚合酶链式反应检测胎膜组织Toll样受体4(TLR-4)、核因子-κB(NF-κB)表达情况，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计、合成及提纯，引物序列如下：TLR-4正向引物5’-GAGGCAGCTCTTGGTGGAAGTTG-3’，反向引物5’-CAAGCACACAGGACCGACAC-3’，长度138 bp；
NF-κB正向引物5’-GATGTGGCATTGGCTATGGGTAT-3’，反向引物5’-GTCACTCTGCCTGGAACCTGTC-3’，长度185 bp；
内参GAPDH正向引物5’-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3’，反向引物5’-AGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’，长度226 bp；
扩增条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，65 ℃退火30 s，40个循环，最后72 ℃延伸10 min；
扩增产物行2%琼脂凝胶电泳，并使用紫外光凝胶成像系统摄像观察，采用2-△△Ct法，以目的基因TLR-4、NF-κB与内参GAPDH的比值作为其mRNA相对表达量。HIE的诊断及临床分度参考《新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准》[7]，临床分度有Ⅰ度(激惹兴奋，发病1 d内症状明显，2～3 d可消失，伴自发动作增多)、Ⅱ度(嗜睡或迟钝，上肢肌张力下降，原始反射减弱，伴或不伴惊厥)、Ⅲ度(昏迷，肢体肌张力及原始反射消失，惊厥发作频繁，常伴颅内压增高)；
根据是否发生HIE，将HCA组分为HCA-HIE组与HCA-非HIE组2个亚组。
2.1 两组孕产妇一般资料比较 两组孕产妇年龄、产次及早产史比较差异无统计学意义(均P>0.05)，HCA组破膜孕周低于对照组、新生儿出生体重高于对照组(均P<0.05)，见表1。
表1 两组孕产妇一般资料比较
2.2 HCA组与对照组HIE发生情况比较 HCA组发生19例HIE，其中Ⅰ度7例，Ⅱ度8例，Ⅲ度4例，对照组发生1例Ⅰ度HIE，HCA组HIE发生率明显高于对照组(χ2=18.332，P<0.001)。
2.3 HCA-HIE组、HCA-非HIE组与对照组胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量比较 HCA-HIE组胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量明显高于HCA-非HIE组及对照组(均P<0.05)，HCA-非HIE组高于对照组(P<0.05)，见表2。
表2 三组孕产妇胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量比较
2.4 HCA孕产妇HIE临床分度与胎膜组织TLR-4、NF-κB表达水平的相关性 HCA孕产妇HIEⅠ度者胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量明显低于Ⅱ度及Ⅲ度者(均P<0.05)，Ⅱ度者低于Ⅲ度者(P<0.05)，见表3。Spearman相关分析显示，HCA孕产妇HIE临床分度与胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量呈显著正相关(r=0.379、0.394，均P<0.05)。
表3 HCA孕产妇不同HIE临床分度者胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量比较
虽然HCA与胎儿窘迫、新生儿败血症、新生儿神经系统发育异常等多种新生儿不良结局有关，但HCA产前无明显临床症状，产前诊断困难，主要由产后胎盘病理诊断，HCA诊疗仍是产科难题[8]。有报道[9]表明，阴道内微环境随着妊娠的进程逐渐趋于稳定，上行感染风险逐渐降低，故胎膜早破孕周越小越易发生宫内感染及不良结局。本研究中，HCA组破膜孕周低于对照组，新生儿出生体重高于对照组，与上述报道一致，提示对于较小孕周的胎膜早破，应警惕HCA，并注意与宫内感染相关的不良结局。
分析HCA与新生儿不良结局的关联性及其作用机制，是近年研究的热点[10]。据文献[11]报道，HCA引起胎盘功能异常，胎盘血流量减少，造成胎儿缺血缺氧，诱发脑损伤，且感染刺激子宫收缩，增加产时窒息发生风险，也易造成HIE。也有研究[12]表明，围产期的宫内感染也能引起胎儿神经元敏感性增加，缺氧缺血时更易发生神经元凋亡，导致HIE。本研究发现，HCA组HIE发生率明显高于对照组，提示HCA可能增加HIE发生风险，与上述研究结果一致。HCA可能通过促进胎盘功能异常及刺激子宫收缩等多种方式，增加HIE等新生儿不良结局发生风险。
另据文献[13]报道，多种细胞因子参与感染引起HIE的发生机制，感染引起促炎因子增多，抑炎因子减少，细胞因子平衡被打破，刺激一氧化氮等损伤介质合成及释放，诱导神经元凋亡。不仅如此，感染及炎症可激活血管内皮细胞，影响凝血-纤溶系统，造成血管内细胞黏附、血栓形成，诱导多重级联反应，引起缺氧缺血等一系列病理改变，损伤越重，患儿智力越低下，预后越差[14-15]。郭孝君等[16]研究指出，HCA症状隐匿，监测淋巴细胞比例、中性粒细胞计数、血小板淋巴细胞比值等系统性炎症参数可尽早识别HCA，指导临床诊疗，以减少HCA引起的新生儿不良结局。因此，分析与HCA发生、发展有关的炎症参数，对控制新生儿不良结局有积极意义。TLR-4/NF-κB是机体重要信号通路，可介导炎性反应与氧化损伤，参与缺血再灌注损伤等多种生理病理过程[17]。近年研究还发现[18]，TLR-4/NF-κB信号通路可参与绒毛膜羊膜炎的发生。本研究结果显示，HCA-HIE组胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量明显高于HCA-非HIE组及对照组，HCA-非HIE组高于对照组，提示TLR-4/NF-κB信号通路可能参与HCA的发生，还可能与HCA诱发HIE的发生机制有关。分析其原因可能为：病原菌入侵活化TLR-4，触发含白细胞介素-1受体结构域，激活NF-κB，引起下游大量促炎因子产生，促进细胞基底膜破坏，加剧胎膜屏障损伤，诱发HCA及不良结局[19-20]。不仅如此，HCA孕产妇HIE临床分度与胎膜组织TLR-4、NF-κB mRNA相对表达量呈显著正相关，提示TLR-4/NF-κB信号通路与HCA诱发HIE的病情进展密切相关。考虑与TLR-4/NF-κB信号通路的激活可诱导血管内皮细胞损伤，胎膜组织TLR-4、NF-κB 的大幅度上调提示胎盘功能受损，胎盘血流量严重下降，促进胎儿缺血缺氧性损伤，使HIE进展加快有关[21-22]。然而，HCA诱发HIE与TLR-4/NF-κB信号通路的关联性未见相关报道，本研究可为后续临床研究提供新思路，但本文结果还需后续研究的论证。
综上所述，HCA孕产妇发生HIE风险更高，TLR-4/NF-κB信号通路可能参与了HCA诱发HIE的发生与发展。
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