吴杰妍 凌钦亮
广州中医药大学第三附属医院 广东 广州 510378
近10 年来，国内的婴幼儿哮喘累及发病率增加超过50%，患病率增加超过50%，严重影响婴幼儿的生长发育［1，2］。悬浮于空气的颗粒物（particulate matter，PM）是大气污染的罪魁祸首，颗粒物具有颗粒小及表面积大的特点，可引起呼吸道病变，随着病程的进展，气道可产生不可逆的重塑或缩窄，严重时可引起呼吸困难。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，p38MAPK 是MAPKs 家族中的主要成员，p38MAPK 通路受到炎性因子、细菌病原体或应激刺激等胞外刺激而被激活，通过磷酸化转录因子调节细胞因子效应基因表达，如激活转录因子、蛋白激酶或核内蛋白质等，影响RNA 转录及蛋白合成，进而调节特定基因表达，引起系列生物学反应而参与细胞生长、发育、分化及凋亡等过程。研究显示与呼吸道病变的气道炎症 与 气 道p38MAPK 通 路 活 化 有 关［3，4］。本 研 究 将幼鼠暴露于模拟的颗粒物环境，分析颗粒物对幼鼠呼吸道的影响及对p38MAPK 通路的调控作用，为婴幼儿呼吸疾病研究提供参考。
1.1 实验动物SPF 级健康幼年SD 大鼠（以下简称幼鼠），雌雄各半，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号：4402102032，体质量（180±15）g，年龄4～5 周。适应性饲养1 周后开展试验。本研究获我院动物实验伦理委员会批准，实验过程符合科技部制定的《善待实验动物的指导性原则》。
1.2 试剂及药物PM 标准品（SRM1649a），成分为多环芳烃类及多氯联苯类，颗粒直径6.7～100 μm，均值24.4 μm，购自美国商务部国家标准技术委员会；
白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factors，TNF）-α 与C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海济宁酶有限公司；
lysis buffer A、DAB 显色试剂盒、BCA 蛋白质浓度测量试剂盒、聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒、蛋白质提取试剂盒均购自上海生工生物技术有限公司。兔抗鼠P-p38MAPK、p38MAPK（美国Abcam 公司）。Heraeus 型贺力氏台式高速冷冻离心机（美国索福公司原杜邦离心机部和德国贺利氏仪器公司）；
6010 型紫外可见分光光度仪（美国Agilent Technology 公司）；
AE200 电子分析天平（上海天平仪器厂）。
1.3 建模方法将幼鼠分为4 组：对照组、PM 暴露组、PM 暴露+运动干预1 组和PM 暴露+运动干预2 组，每组10 只，雌雄各半。将SRM1649a 置于灭菌的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，使用前采用超声仪超声5 min，采用多功能雾化器，密闭环境的PM 剂量为（150±10）μg/m3，每天将PM 暴 露 组、PM 暴 露+运 动 干 预1 组 和PM 暴露+运动干预2 组的幼鼠置于雾化器中6 h（9：00—12：00，14：00—17：00），连续雾化12 周。对照组同期给予PBS 液雾化吸入。
1.4 运动对PM 暴露+运动干预1 组和PM 暴露+运动干预2 组在雾化同期进行运动干预，运动为纵跳和游泳：PM 暴露+运动干预1 组大鼠纵跳跳箱和电刺激箱作为大鼠纵跳的练习平台。跳跃第1天至第3 天的跳跃高度为10 cm，第4 天开始每天升高2 cm，直至24 cm，每天跳跃20 次，4 d/周；
第1 天游15 min，连续3 d，第4 天游20 min，连续3 d，第8天开始每天游泳30 min，水温（29±l）℃，游泳池水深40 cm，4 d/周。PM 暴露+运动干预2 组在运动1 组基础上，次数或时间增加1 倍，即每天跳跃40 次，第1 天游30 min，连续3 d，第4 天游40 min，连续3 d，第8 天开始每天游泳60 min。所有运动均持续12 周，雾化结束，运动干预结束。对照组、PM 暴露组不给予运动干预。
1.5 指标检测
1.5.1体质量 雾化及运动结束后，称重各组幼鼠。
1.5.2气道反应性 雾化及运动结束后，采用Buxco 系统检测幼鼠气道的反应性。采用戊巴比妥钠腹腔注射，全麻幼鼠，气管插管并依次雾化吸入盐 酸 组 胺，浓 度 分 为0、0.01、0.02、0.04、0.08 及0.16 mg/mL，各持续20 s，以盐酸组胺0 mg/mL 的阻力值为基础值1.0，换算其余浓度的阻力值。
1.5.3炎症因子 雾化及运动结束后，全麻幼鼠，开腹，吸取腹主静脉血5 mL，置于非抗凝管。取一硬硅胶管固定在左主支气管内，用37 ℃无菌生理盐水对左肺行支气管肺泡冲洗得到支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），将静脉血和BALF 分别离心得血清和BALF 上清，采用酶联免疫吸附法测定血清BALF 中的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 与CRP 水平。
1.5.4肺、脾和胸腺的脏器指数、HE 染色 安乐处死各组幼鼠，取幼鼠的肺脏、胸腺和脾脏，称重，计算脾脏和胸腺的脏器指数，脏器指数=（幼鼠脏器质量/幼鼠体质量）×100%。取气道，置于中性甲醛溶液中固定48 h，HE 染色，镜下观察。
1.5.5p38MAPK 通路相关蛋白 用Western Blot法测定气道p38MAPK 通路相关蛋白质。取1.5.4项下气道，加组织完全裂解液lysis buffer A 在冰上超声混匀，以打破组织，离心弃去上清，用PSB 溶液重悬，室温孵育，离心收集上清，用BCA 法测定蛋白浓度，经SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转至PVDF 膜上，封闭并加兔抗鼠p38MAPK 一抗、兔抗鼠p-p38MAPK 抗体与兔抗鼠β-actin 一抗，4 ℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记二抗孵育，显影，用QuantityOne 5.0 软 件 得 到 P-p38MAPK 及p38MAPK 相对表达，p38MAPK 激活程度=P-p38MAPK/p38MAPK。
1.6 统计学方法采用SPSS 17.0 进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNQ检验，检验水平α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 各组幼鼠的体质量、肺指数、胸腺指数和脾脏指数比较与对照组比，PM 暴露组体质量明显降低（P＜0.05），肺指数、胸腺指数和脾脏指数均明显增高（P＜0.05）；
与PM 暴露组比，PM 暴露+运动干预1 组和PM 暴露+运动干预2 组体质量明显增高（P＜0.05），肺指数、胸腺指数和脾脏指数均明显降低（P＜0.05），且与运动干预量呈依赖性趋势，见表1。
表1 各组幼鼠的体质量、肺指数、胸腺指数和脾脏指数比较
2.2 各组幼鼠的气道反应性比较与对照组比，PM 暴露组气道反应性明显增高（P＜0.05）；
与PM暴露组比，PM 暴露+运动干预1 组和PM 暴露+运动干预2 组气道反应性明显降低（P＜0.05），且与运动干预量呈依赖性趋势，见表2。
表2 各组幼鼠的气道反应性(cmH2O/(mL·s)
2.3 各组幼鼠血清和BALF 中炎症因子比较与对照组比，PM 暴露组 血清和BALF 的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 和CRP 均 明 显 增 高（P＜0.05）；
与PM 暴 露 组 比，PM 暴 露+运 动 干 预1 组 和PM 暴露+运动干预2 组血清和BALF 的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 和CRP 均明显降低（P＜0.05），且与运动干预量呈依赖性降低趋势，见表3 和表4。
表3 各组幼鼠血清炎症因子比较(ng/mL, n=10)
表4 各组幼鼠BALF 炎症因子比较(ng/mL, n=10)
2.4 各组幼鼠气道的HE 比较正常组的气道结构正常，细胞排列紧密，PM 暴露组的气道存在明显的凹陷，气道周围炎性细胞浸润明显，运动干预组的气道存在轻微凹陷，气道周围存在部分炎性细胞浸润，且与运动干预量呈依赖性降低趋势，见图1。
2.5 各组幼鼠气道p38MAPK 通路相关蛋白及激活程度比较P-p38MAPK 与p38MAPK 主要表达在细胞核及细胞质。与对照组比，PM 暴露组气道P-p38MAPK、 p38MAPK 和 P-p38MAPK/p38MAPK 均明显增高（P＜0.05）；
与PM 暴露组比，PM 暴露+运动干预1 组和PM 暴露+运动干预2 组 P-p38MAPK、p38MAPK 和 P-p38MAPK/p38MAPK 均明显均明显降低（P＜0.05），且与运动干预量呈依赖性降低趋势，见表5、图1 和图2。
图1 各组幼鼠气道组织HE 染色(×200，标尺：50 μm)
表5 各组幼鼠气道p38MAPK 通路相关蛋白及激活程度比较
图2 各组幼鼠气道p38MAPK 通路相关蛋白及激活程度比较(Western Blot 法)
图3 各组幼鼠气道p38MAPK 通路相关蛋白表达（×200）
与健康成人相比，婴幼儿的呼吸道、肺、胸腺及脾等呼吸及免疫器官的发育尚未完全，对空气污染物的敏感性较高，更易产生负面的健康效应，增加了婴幼儿的呼吸系统疾病的发病率［5］。本实验也显示，与对照组比，PM 暴露组经12 周持续的模拟大气PM 雾化，气道已显出炎症反应，肺、脾和胸腺指数增大，提示大气PM 污染可引发气道慢性炎症。
MAPK 是存在于细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过将细胞外的刺激传入细胞核并引起生物学反应。p38MAPK 是MAPKs 家族中的主要成员，由360 个氨基酸构成的蛋白质，参与“刺激信号-活 化 因 子-MAPKKK-MAPKK （MAKK）-MAPK（P38MAPK）-底 物”的 酶 促 级 联 反 应。P-p38MAPK 可激活T 环上三肽基“TXY”中邻近的T（酪氨酸）与Y（苏氨酸）的双重磷酸化，作为p38MAPK 的活化形式，即p38MAPK 通过磷酸化转录因子来调节细胞因子效应基因的表达，P-p38MAPK 改变蛋白构象，激活各种底物，参与多种 反 应，P-p38MAPK/p38MAPK 越 高，p38MAPK活化程度越高。炎性因子或应激刺激等多种因素可激活p38MAPK 通路，被激活的p38MAPK 可作用下游特定的效应器，如激活转录因子、蛋白激酶或核内蛋白质等，影响RNA 转录及蛋白合成，调节特定基因表达［6］。
呼吸道病变的最大病理特征在于炎症反应。研究发现呼吸道病变与炎症相关的通路较多，如NLRP3/IL-1β/TGF-β1、IRF7-IFN-α 和MAPK，其中研究较多较成熟的是MAPK 信号通路［7］。如本研究结果显示，与对照组比，PM 暴露组气道反应性明显增高，且外周血及BALF 中的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 和CRP 水 平 明 显 增 高，同 时p38MAPK 信号转导通路相关蛋白p38MAPK 和P-p38MAPK 表 达 增 高，P-p38MAPK/p38MAPK 也增高，提示PM 暴露可刺激炎症反应，激活p38MAPK 信号通道，p38MAPK 信号转导通路的激活与炎症反应密切相关，该结果与文献报道类似。如Huang 等［8］研究显示，颗粒物可以通过氧化应激和炎症反应引起肺损伤，氧化应激和炎症反应可激活p38MAPK 通路。Zhen 等［9］认为颗粒物诱导细胞凋 亡 和MAPK 通 道，MAPK 信 号 通 路 在PM2.5 诱导的皮肤损伤中起关键作用。
研究显示，运动可显著减轻炎症反应，可能与运动调控气道的p38MAPK 信号通道相关［10］。运动可通过抑制p38MAPK 信号通道减轻疾病严重程度，如龚彦豪等［11］发现运动通过调控MAPK 信号通道的ERK 和p38MAPK 水平达到保护急性力竭心脏损伤；
Baghaiee 等［12］认为早期运动干预通过降低心脏组织p-p38 MAPK 蛋白表达改善心脏组织的重塑病变；
王洋等［13］对雄性SD 大鼠给予运动干预，结果显示运动通过调控p38MAPK 蛋白表达增加了骨骼肌总蛋白的合成，预防骨骼肌萎缩。但也有研究［14，15］显示，过度运动可促进炎症反应，诱发哮喘或其他病变，如李改新［16］研究表明对哮喘儿童进行不同方式一次运动均可使外周白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞计数增高；
郑妩媚等［6］研究显示，过度运动或高强度运动可上调心肌组织的p38MAPK 表达，增强炎症反应，给予p38MAPK 抑制剂SB203580 可显著降低炎症反应；
Zhang 等［17］研究认为，运动可用于预防血压升高和改善血管功能，与运动调控p38MAPK 通道进而调控血管平滑肌细胞表型转换相关。本课题设定了2 种不同量的运动干预，大量指标显示出运动量相关的趋势变化，可见本研究的运动剂量尚未达到过度的程度，而且运动在调控p38MAPK 存在双向效应，因此下一步研究有必要考察运动强度、持续时间及运动间隔等与p38MAPK 通路的关联。
综上，颗粒物可激活幼鼠呼吸道的p38MAPK通路，给予运动干预可降低p38MAPK 通路的P-p38MAPK、p38MAPK 蛋白表达，降低炎性反应，改善肺、脾和胸腺的脏器指数。长期暴露在大气污染的环境可激活呼吸道的p38MAPK 通路，引发炎症反应，适当运动可抑制p38MAPK 通路活性，降低炎症，改善肺功能及免疫功能。
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