边汉亮， 段超龙， 曲肇伟， 石 磊， 张建伟
（1.河南大学土木建筑学院，河南 开封 475004；
2.开封市特殊土改性与修复工程技术研究中心，河南 开封 475004；
3.九州工程设计有限公司，河南 开封 475003）
土壤是保障农业和社会经济可持续发展至关重要的自然资源，是生态环境的重要保护对象。随着我国农业现代化的发展，国内粮食产量稳步提高，但存在过量使用化肥、农药等含有重金属物质的现象，造成土壤中重金属含量超标，引发农田土壤重金属污染。据相关调查，我国受重金属污染的土壤面积超过2 000 万hm2，约占全国总耕地面积的1／5，年经济损失超过200亿元［1］，农田土壤重金属污染治理修复尤为必要。
目前，重金属污染土常见的修复方法主要包括物理修复、化学修复和生物修复等［2］，但这些修复技术普遍存在修复周期长、成本高、修复效果不稳定等问题，甚至有些还会对土体产生二次污染。利用微生物诱导碳酸钙沉淀（Microbially Induced Carbonate Precipitation，MICP）或植物脲酶诱导碳酸钙沉淀（Enzyme Induced Carbonate Precipitation，EICP）技术矿化重金属离子产生沉淀的研究逐渐兴起，通过向土体中加入微生物或脲酶水解尿素产生碳酸根离子，同时在土中加入氯化钙溶液，从而对污染土中的重金属离子产生矿化或固定化作用，达到治理修复重金属污染土的效果［3-4］。
文献［5-6］中分别利用黄色考克氏菌CR 1 和芽孢杆菌水解尿素产生的CO23－对重金属铅污染土进行修复试验研究，发现经处理后污染土中的Pb2＋主要以碳酸盐结合态存在。成亮等［7］利用碳酸盐矿化菌株A所产生的脲酶水解尿素生成CO23－，发现游离态的Cd2＋能够与CO23－生成稳定的CdCO3不溶晶体沉淀。对于MICP技术需要采用特定的产脲酶细菌，细菌的筛选、接种、培养过程较为繁琐，而植物脲酶同样可以起到分解尿素的作用，同时在植物的根、茎及种子中存在丰富的脲酶，因此EICP 技术得到快速发展。文献［8-10］中从不同植物种子中提取出可以催化尿素水解成CO23－的脲酶，吴林玉等［11］利用从大豆中提取的脲酶进行了EICP 技术固化砂土试验，验证了从植物中提取脲酶的可行性。虽然MICP 或EICP 技术处理重金属污染土无二次污染，但在矿化重金属的过程中会生成大量碳酸钙，形成具有一定强度的硬壳层，对农作物生长发育产生影响，因此对MICP／EICP处理重金属污染农田土需进行一定的改进。
本文提出脲酶诱导碳酸盐沉淀技术，通过从大豆中提取脲酶，利用脲酶水解尿素产生的CO23－与污染土中游离的重金属离子结合，形成以碳酸盐为沉淀物的稳定态结构，从而降低污染土中重金属离子的迁移性和生物有效性，达到固化修复的目的。与MICP／EICP技术相比，该方法无需加入氯化钙，减少了碳酸钙的生成，具有环境友好、费用低等优点，本研究对该技术处理重金属污染土的机理与处理效果进行研究，为后续该方法的推广应用提供参考。
1.1 试验土体
试验土样取自开封市郊区农田土，属于典型的黄泛区粉土，土体参数如下：液限ωL＝25.8%，塑限ωP＝16.4%，塑性指数Ip＝9.4，最大干密度ρdmax＝1.67 g·cm－3，最优含水率ωopt＝15.6%，pH ＝8.5。颗粒级配曲线如图1 所示。测得土壤中铅含量为56 mg／kg，将土样放入100 °C烘箱内烘干并用2 mm筛去除杂质后备用。
图1 试验土体颗粒级配曲线
1.2 大豆脲酶的制备及活性测定
本试验采用的脲酶为粗酶提取法所提取的粗酶，将从市场上买来的黄豆在50 ℃烘箱中放置8 h，烘干后用粉碎机粉碎成粉末状。为提高脲酶提取率，采用多批次少量放入粉碎机的方法粉碎。将粉碎后的豆粉过2 mm 筛去除豆渣后称取100 g 放入烧杯中，加入500 mL纯水后用磁力搅拌器搅拌0.5 h，静置1 h后放入温度为4 ℃、转速3 500 r／min的冷冻离心机内离心15 min，离心后的上清液即为大豆脲酶溶液。为保证脲酶活性，将脲酶溶液放入5 ℃冰箱内冷藏，随用随取。
脲酶活性与电导率的变化成正比，可通过测量溶液电导率变化值来间接衡量脲酶活性［12］。具体测定方法为：将1 mL 大豆脲酶溶液与9 mL 浓度为1.11 mol／L的尿素混合，采用雷磁DDB-303 A 便携式电导率仪每5 min 测量一次脲酶-尿素混合溶液电导率变化值，共测量3 次取变化平均值。根据下式计算大豆脲酶的活性：
式中：y为大豆脲酶活性（mmol／（L·min））；
K 为稀释倍数；
X为电导率的变化值（mS／cm）；
T为时间（min）。
1.3 污染土的制备与固化修复
所取土样为未污染土，采用人工制样的方法配制重金属污染土。按照农用地土壤铅污染风险管控制值的2 倍2 000 mg／kg 制备污染土，称取4.66 g 的Pb（NO3）2溶于300 mL 去离子水中制备成硝酸铅溶液，从中取100 mL 倒入500 g 上述烘干的土样中，搅拌均匀，即得到含铅量为2 000 mg／kg 的污染土。将制备好的铅污染土在室内通风良好的条件下放置2 周风干，得到待处理的重金属铅污染土。
称取上述若干份污染土试样，分为3 组，每组设置3 个平行试样，分以下步骤进行固化修复试验：
（1）将50 mL大豆脲酶溶液和50 mL尿素溶液混合后以拌和的方式加入土体中，拌和均匀后土体在室温条件下静置1 周使其充分反应，待风干后对土体中Pb2＋各形态含量进行检测。
（2）按照相同的方法对步骤（1）中的铅污染土再进行一次修复，待风干后对土体中Pb2＋各形态含量进行检测。
（3）重复步骤（1）对步骤（2）中的铅污染土再次进行修复，待风干后对土体中Pb2＋各形态含量进行检测。
1.4 Pb2 ＋含量的检测
通过Tessier 5 步连续提取法对修复前和不同修复次数的铅污染土中各金属形态进行分析［13］，分别得到铅离子的可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机质及硫化物结合态和残渣态，利用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-AES）对提取的各形态重金属含量进行检测。
1.5 Ca2 ＋对修复效果的影响
与MICP／EICP相比，本试验是在不添加钙源的条件下对重金属污染土进行固化修复，为了研究Ca2＋在大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀过程中对Pb2＋固化修复效果的影响，在大豆脲酶与尿素混合溶液中加入CaCl2对铅污染土进行固化修复，采用ICP-AES 测得污染土中Pb2＋含量。根据前期预实验结果可知，当修复次数为3 次时，Pb2＋的固化修复效果基本达到稳定，再增加修复次数固化修复效果提升不明显。因此，本试验对污染土的修复次数设定为3 次。
1.6 微观分析
将大豆脲酶溶液与尿素溶液混合后倒入含有Pb2＋的水溶液中，充分反应后将沉淀物质过滤、烘干得到白色沉积物，然后将所得白色沉积物和固化修复前后的铅污染土分别采用场发射扫面电镜（SEM）和X射线衍射仪（XRD）进行形貌和成分分析，得出大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀固化修复重金属Pb2＋的机理。SEM采用带有能谱仪的场发射扫描电镜系统（JEOL JSM-7610 F Plus）观测；
XRD 试验采用X 射线衍射仪（布鲁克D8 ADVANCE）观测，扫描范围为10° ～90°，步宽为0.02°。
2.1 脲酶活性的影响因素
脲酶的化学本质是蛋白质，脲酶活性的影响因素除了温度和pH 外，还与脲酶本身的浓度有关。本文参照吴林玉［11］的试验结果，控制试验环境温度为30℃，pH 为8，配制豆粉浓度为50 ～150 g／L（10 g／L递增），采用1.2 节所述方法对脲酶活性进行测试，得到不同豆粉浓度下的脲酶活性如图2 所示。由图2 可知，在温度和pH一定的情况下，脲酶活性随豆粉浓度的增加线性增加，与Gao 等［14］试验结果相似，通过拟合得到：
图2 不同豆粉浓度下的脲酶活性
其中：y代表脲酶活性；
x代表豆粉浓度。
从图3 可以看出，豆粉浓度在50 ～100 g／L 时单位质量大豆，脲酶活性随着豆粉浓度的增加而降低，在100 ～150 g／L时脲酶活性趋于稳定，说明豆粉浓度为100 g／L 时已接近单位质量大豆脲酶活性的极限，因此，为了最大限度地提高脲酶活性，节约成本，本文选用豆粉浓度为100 g／L进行污染土修复试验研究。
图3 不同豆粉浓度下的单位质量脲酶活性
2.2 重金属污染土修复效果分析
从图4 中可以看出，随着修复次数的增加，可交换态Pb2＋含量逐渐下降，经过一次修复土壤中可交换态Pb2＋含量就可减少71.35%，修复2 次时大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀技术对重金属污染土修复效果基本达到稳定，此时可交换态Pb2＋的去除率达到84.19%，证实该技术可以有效减少土壤中可交换态重金属的含量。另外，土壤中碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态含量呈上升趋势，而有机质结合态和残渣态的含量虽有增加，但变化并不明显。雷鸣等［15］研究表明，重金属的碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态相比可交换态不易被生物吸收利用，降低了重金属在环境中的迁移性，说明土壤重金属污染得到有效缓解。
图4 不同修复次数下Pb2 ＋各形态含量
2.3 添加CaCl2 对去除率的影响
由图5 可见，加入CaCl2的去除率与不加CaCl2修复Pb2＋去除率均随着修复次数增加而升高。修复2次时，不加CaCl2的去除率高于加入CaCl2的去除率；
在修复3 次时，添加CaCl2的去除率与不加CaCl2的去除效果接近。分析其原因，在碳酸盐生成过程中，Ca2＋相较于Pb2＋更活泼，即更易于与CO2－3相结合，减少了PbCO3的生成量，因此修复2 次时加CaCl2的去除率相较于不加CaCl2修复效率偏低，但同时Ca2＋的引入可以缓解重金属Pb2＋对脲酶活性的抑制作用，生成更多的碳酸盐沉淀。许朝阳等［16］研究表明，在CaCO3形成的过程中可吸附或包裹Pb2＋，将游离态的重金属离子以共沉淀的方式去除，提高了Pb2＋的去除率。与不添加CaCl2相比，Ca2＋的引入虽然提高了可交换态Pb2＋的去除率，但去除效率的提高幅度较小，经济性降低。
图5 CaCl2 对可交换态Pb2 ＋去除率的影响
2.4 修复机理分析
2.4.1 水溶液矿化机理分析
大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀处理含Pb2＋的水溶液沉积物扫描电镜如图6 所示。不同倍率的SEM 照片都显示，过滤烘干后的沉积物呈团絮状，结晶良好，颗粒间连接密实，证实大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀能够将游离态Pb2＋矿化成稳定的团聚态沉淀。对沉积物主要成分能谱（见图7）进行分析，可以看出，沉积物的成分主要由C、O、Pb3 种元素组成，结合X 射线衍射仪（见图8）对该沉积物进行定性分析，证明生成的沉积物为碳酸铅，该过程的反应原理如下：
图6 含Pb2 ＋水溶液沉积物扫描电镜图
图7 水溶液沉积物能谱图
图8 水溶液沉积物XRD
2.4.2 Pb2 ＋污染土矿化机理分析
经过2 次修复后的铅污染土放大1 000 倍的扫描电镜照片如图9 所示。从图中可以明显观察到土颗粒表面分布着大量不规则晶体，这与水溶液反应生成的沉积物非常类似，采用XRD 对铅污染土固化修复前、后土体组成成分进行分析（见图10），发现大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀技术修复后的土体中有PbCO3生成，表明大豆脲酶能够催化尿素水解产生CO2－3并与污染土中Pb2＋结合生成PbCO3沉淀，从而将污染土中的重金属离子固化封存起来，减少其迁移性达到修复的目的。
图9 修复后污染土电镜图（×1 000）
图10 修复前、后污染土XRD
综上所述，大豆脲酶水解尿素产生的碳酸根离子能够与污染土中的铅离子生成碳酸盐沉淀物，可以有效减少土壤中可交换态铅离子的含量，增加稳定态铅离子含量，从而对铅离子进行固化，达到修复铅污染土的目的。因此大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀技术在重金属污染土修复中具有较好的应用潜力。
利用大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀技术对人工制备的铅污染土进行室内处理试验研究，结合微观试验对该技术的修复机理进行分析，主要结论如下：
（1）大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀技术可以有效固化修复重金属铅污染土，经过2 次处理后可以使土壤中铅离子的可交换态含量降低84.19%。
（2）处理2 次时，可交换态Pb2＋的去除率高于加CaCl2修复方法，随着处理次数增加，Ca2＋的引入可以提高可交换态Pb2＋去除率，但增加了修复次数，经济性降低。
（3）通过SEM、EDS和XRD 等微观分析，大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀技术能够将土壤中游离的Pb2＋固化在土颗粒表面，减少其在环境中的迁移性，达到固化修复的目的。
虽然大豆脲酶诱导碳酸盐沉淀技术对重金属污染土有良好的固化修复效果，但本文只对Pb污染土进行了修复处理，对于其他重金属污染土的处理效果，有待于进一步研究。
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