朱丽华，朱 波，芮 棵，熊御云，夏 琳，阴 晴
（江苏大学附属医院检验科，江苏 镇江 212001）
肺炎是一类临床上常见的肺部感染性疾病[1]。该病发病率高、病死率也高，尤其是重症肺炎。及时确定患者体内病原体的种类，了解致病菌的耐药情况是对肺炎患者进行药物治疗的必要条件。目前肺炎病原体常用的临床检测方法有涂片、细菌培养[2]、聚合酶链式反应及免疫血清学等，但这些方法存在周期长、过程复杂、灵敏度低及不能检出未知病原体等缺点，已不能完全满足临床需求。近年来，随着宏基因组二代基因测序技术[3]（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）的不断发展，mNGS逐渐成为感染性疾病一种新的病原学检测方法。mNGS不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物，且无需特异性扩增，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。本次研究主要是探讨肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）mNGS在肺炎病原感染谱检测中的应用价值评估。
1.1 一般资料 选择 2020年6月—2021年6月在江苏大学附属医院住院的56 例肺炎患者，纳入标准[1]：①符合社区获得性肺炎的诊断标准；
②抗生素治疗72h后，患者体温仍持续＞38 ℃和（或）咳嗽咳痰、呼吸困难等临床不适症状仍存在[1]；
具体标准如下：发热＞38 ℃且持续 3 d及以上；
呼吸道的主要症状无改善或者进行性加重；
肺部影像学有进展；
抗生素使用升级；
患者病情恶化需要进一步进行机械通气。
1.2 方法
1.2.1 BALF的收集：患者在咪达唑仑静脉镇静下，使用2%的利多卡因进行气道黏膜表面局部麻醉。经鼻进镜，将支气管镜末端伸入病变段或肺叶，温热生理盐水（1 mL/kg）进行灌洗3 次，灌洗后立刻负压抽吸，将回吸收的BALF吸收至痰液收集器中[2]。
1.2.2 BALF的送检：同时留取两份BALF标本各3mL于无菌杯中，其中一份外送华大基因公司进行病原微生物mNGS检测。另一份送本院检验科微生物室进行传统微生物培养（细菌培养和真菌培养）及抗酸染色涂片。mNGS标本的采集、保存和运输严格按照华大基因公司的规范进行操作。
1.2.3 传统的微生物分离培养及鉴定：取BALF标本10 μL分别接种5%羊血琼脂平板、巧克力平板和沙堡罗平板。35 ℃、5% CO2培养过夜，BALF培养菌落≥104CFU/mL为阳性结果，低于上述菌落计数为阴性。菌落的鉴定采用布鲁克质谱仪进行分析。
1.3 统计学处理 选择统计软件SPSS 23.0进行数据分析处理。计数资料以例数或百分率表示，mNGS与传统微生物培养检测结果之间的比较采用配对χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 BALF mNGS和传统培养病原微生物检测结果及病原分布
2.1.1 BALF mNGS病原微生物检测结果及病原分布：56 例BALF标本，mNGS检测出38 种微生物，共69 株，其中细菌感染（36/69）最为常见，其中鲍曼不动杆菌（7/36）为最常见的感染菌，其次为铜绿假单胞菌（4/36）、肺炎链球菌（3/36）、肺炎克雷伯菌（3/36）及结核分支杆菌（3/36），其他感染菌为堪萨斯分支杆菌（2/36）和流感嗜血杆菌（1/36）等。共检出真菌19 株（19/69），在真菌感染中最为常见的是白假丝酵母菌（6/19）和耶氏肺孢子菌（5/19），其次为曲霉菌（4/19）。检出病毒10 株（10/69），病毒感染中以巨细胞病毒（3/10）最为常见，其中分离出2019新型冠状病毒（SARS-CoV-2）1 株（1/10）。检出非典型病原体2 株：鹦鹉热衣原体和肺炎支原体各1 株。
2.1.2 传统微生物培养病原微生物检测结果及病原分布：56 例BALF标本中，传统微生物培养法检出10 种微生物，共23 株，其中细菌17 株（17/23），分别为鲍曼不动杆菌（7/17）、铜绿假单胞菌（4/17）、肺炎克雷伯菌（2/17）、屎肠球菌（2/17）、基质贪铜菌（1/17）和肺炎链球菌（1/17）；
检出真菌6 株（6/23），主要为白假丝酵母菌（4/6）。
2.2 两种方法病原微生物检出种类的比较 56 例BALF标本中，45 例标本（80.4%）mNGS结果为阳性，其中30 例标本（53.6%）检出一种病原微生物，12 例标本（21.4%）检出两种病原微生物，3例标本（5.4%）检出三种及三种以上病原微生物；
而传统微生物培养法仅检出21 例病原微生物，阳性率为37.5%。（表1）
表1 两种方法病原微生物检出种类数比较[例(%)]
2.3 两种方法检出率及一致性的比较 56 例BALF标本中，发现21 例标本（37.5%）两种检测方法均为阳性，且对细菌及真菌鉴定结果相同，11 例标本（19.6%）两种检测方法均为阴性，说明mNGS对病原微生物阳性检测率及病原种类方面，与传统培养法相比具有较好一致性。传统微生物培养为阴性而mNGS为阳性有24 例（42.9%），两种检测方法差异具有统计学意义（P＜0.05），而这24 例的病原体分布主要为病毒、支原体和真菌，说明mNGS在病毒、支原体和真菌的检测方面比传统微生物培养具有明显的优势，两种检测方法对病毒、真菌及细菌检测差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表2，表3）
表2 两种方法的检出率比较[例]
表3 两种方法对不同病原体的检出的数目（例）
肺炎是一类由细菌、病毒、支原体等病原体引起的肺部感染性疾病。临床实践表明，早期、快速精准确定病原微生物，正确选择有效抗生素是肺炎诊治的关键。目前肺炎病原体的实验室常规检测手段主要包括肺炎患者痰、BALF、血液等标本的微生物培养与鉴定、定量PCR及免疫荧光等方法。然而，这些常规方法存在病原体检出阳性率低、只能根据已知病原体特点进行检测等缺点，不利于医生的早期诊断及合理用药。近几年，随着测序技术和生物信息学的快速发展以及测序成本的降低，微生物mNGS技术正逐渐从科研走向了临床，被应用于临床标本病原微生物的筛查与鉴定，成为病原学诊断的一种新的检测手段[3]。
微生物mNGS技术具有灵敏度高、高通量等特点，目前，已有超过38 000 个细菌基因组和超过5 000 个病毒基因组的序列被测定，其中包含了绝大部分与呼吸道感染性疾病相关病原体[4-6]。mNGS高通量技术优势是通过对标本进行无差别测序和生物信息分析，不仅可以确定已知病原体，还可以检测未知病原体[7-9]，如正在全球流行的SARS-CoV-2的快速病原学确定正是依赖于这种高通量测序技术。目前，BALF的病原学检查是临床肺部疾病，特别是肺炎诊断及鉴别诊断的重要手段。细菌、真菌、病毒等病原体引起的肺部早期感染，由于感染早期病原体载量低，很难通过传统培养手段检出病原体且难以鉴定出多种病原体引起的混合感染。本研究通过比较56 例肺炎患者BALF标本的mNGS与培养结果，发现mNGS检测阳性率显著高于传统微生物培养法，这种优势在两种或三种病原体混合感染时表现更为明显。此外，mNGS技术在真菌、支原体及病毒检测方面也显示出较高的敏感性。通过对56 例肺炎患者BALF标本mNGS检测，分析病原分布发现，细菌感染主要为鲍曼不动杆菌，真菌感染主要为白假丝酵母菌，病毒感染主要为巨细胞病毒，且以单一病原感染为主，这也为临床肺炎感染经验用药提供了一定的参考。
综上所述，本研究将高通量测序应用于肺炎患者BALF病原体检测，并比较了mNGS与传统微生物培养两种方法在BALF细菌检出率及检出种类的差异，初步研究结果表明：mNGS的通量高，敏感性高，不仅可以同时检出多种常见菌，还可以检出罕见菌。同时，在真菌、支原体、病毒等病原体检测方面也显示出较高检出能力。此外，通过对比发现两种方法在检出细菌的种类方面具有较好的一致性。因此，mNGS在检测病原体方面具有高通量、高敏感性、高准确性等优点，在肺炎诊断方面具有广阔的应用前景。本研究为高通量测序应用于病原体相关肺炎的精准诊断和治疗提供了有益的探索。但值得注意的是，除培养法外，荧光定量PCR、多重PCR及数字PCR也是感染性疾病特定病原体检测的常用方法[10-11]。与mNGS相比，PCR的灵敏度及通量虽不及mNGS，但PCR的假阳性率更低，检测成本低廉且检测周期更短，目前仍是感染性疾病分子诊断的主流平台。因此，作为肺炎病原体分子诊断技术手段，PCR与mNGS之间是一种优势互补、相辅相成的关系。常规培养、PCR及mNGS检测组合需根据病人病情及临床需要进行选择。
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