柴文波，李淑芬，李洪涛，许瀚元，祝 庆，王 军
（连云港市农业科学院，江苏连云港 222000）
玉米（Zea mays）是世界上重要的粮食作物，目前种植面积位居粮食作物第一，随着人们对玉米需求量的逐渐增大，提高玉米产量已成为亟待解决的问题，而玉米的产量又与玉米种子的优良与否有着极其重要的关系[1]。杂交模式是玉米育种的重要基础性工作，玉米杂种优势群及其杂优模式的研究对于提高玉米育种的效率具有重要意义[2]。杂优模式受到了国内外的广泛重视，特别是近十年来，分子标记技术的飞速发展为在分子水平上研究玉米的杂种优势群及其杂优模式提供了新的手段[3-5]。有学者利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP 等[6]分子标记技术分别对玉米血缘关系明确的玉米材料进行了杂种优势群划分，所得结果与赵旭等研究的系谱基本吻合，同时也有对血缘关系模糊的材料进行杂种优势群划分，所得结果与生产实践中实际应用的杂种优势配对模式也基本一致[7-8]。
SSR 又称微卫星，是由简单的重复单位组成的串联重复序列，主要包括核心序列以及两侧的侧翼序列[9]。一般情况下，微卫星核心序列的串联重复数与其等位基因数有很大的正相关性[10]，而且序列重复次数越多，变异的可能性越大，则该微卫星位点的等位基因数目就越多。微卫星的重复次数在不同物种间、品种间的多态性比较大，但是微卫星两侧的侧翼序列是相对比较保守的单拷贝序列[11]。可根据对其保守的边界序列进行引物设计，并通过PCR 技术获得微卫星片段来分析串联重复次数的遗传变异。目前，SSR 标记是进行分子指纹谱图构建和亲缘关系划分的主要方法。
杂种优势群的选择有利于真实地反映遗传自交系的背景，有助于自交系的改良和杂交种的选配。L239 是国外杂交种选系，L7221 是昌7-2 变异株自交选育，利用L239 和L7221 杂交选育并大规模推广的品种有很多，如隆平206 和红旗968，隆平206具有高产、抗逆、适应性广等特点，是黄淮海地区广泛栽培的玉米品种。本试验主要采用了40 份玉米自交系分析其与L239 和L7221 的亲缘关系，从而确定其杂种优势群，为黄淮海地区杂种优势群的划分提供参考。
1.1 供试材料
供试材料包括42 个玉米自交系，由安徽农业大学玉米研究重点实验室提供。经文献查询[12-14]，42 份玉米自交系的亲本来源见表1。
表1 供试玉米自交系的亲本来源
1.2 DNA 提取方法
采用DNA 快速提取法[15]提取玉米基因组DNA。将玉米种子置于沙土中发芽，待其长到三叶期时取叶片。
1.3 SSR 引物合成
引物序列参考王凤格等[16]的研究，筛选的原则是在染色体上平均分布。56 条引物由上海生物工程有限公司合成。
1.4 PCR 扩增
PCR 扩增体系为20 μL，其中含有10×Buffer 2 μL，DNTPs 1.6 μL，上下游引物稀释为10 ng/μL并加入1 μL，50 ng/μL 的基因组2 μL，酶0.2 μL，水12.2 μL。
热循环反应体系为：94 ℃模板DNA 预变性5 min，94 ℃模板DNA 变性1 min，50～65 ℃引物与模板靶位点结合30 s，72 ℃引物沿模板延伸1 min，共40 个循环；
最后在72 ℃延伸10 min。
1.5 SSR 分析检测
对扩增完的PCR 产物进行稀释，稀释倍数为12 倍，然后进行毛细管电泳分析。
1.6 数据统计分析
在相同分子量大小的位置上，有带的记为“1”，无带的记为“0”。按NEI 等[17]的方法分别计算自交系间的遗传距离（genetic distance，GD），公式为
式中，Pij是自交系i和自交系j共同具有的带数；
Pi和Pj分别为自交系i和j具有的带数。
用SPSS 统计学软件按WARD 连接法对GD进行聚类。按SMITH 等[18]提供的公式计算每1 对SSR 引物的多态性信息量（polymorphism information content，PIC），即
式中，Pi为i位点的基因频率。
2.1 引物退火温度的确定
采用其中的骨干自交系郑58 为模板进行梯度PCR，确定不同引物的最适退火温度。根据图1 选择条带最亮的温度作为该引物的退火温度。经过引物筛选，确定了56 条引物，引物退火温度见表2。采用每条引物的最适退火温度进行后续的试验。
图1 ole1 引物扩增筛选图谱
2.2 SSR 引物的确定
依据扩增产物在毛细管电泳中的可读性、多态性，并且考虑在染色体上的分布情况，最终确定了56 条引物扩增的数据是可行的，并对42 份供试材料进行分析。56 条引物在染色体上的分布情况见图2，共检测到284 个等位基因变异，同时计算各引物在42 个玉米资源上的等位基因数、引物的多态性（PIC）、有效等位基因数（Ne）、基因型多样性（H′）。
图2 56 条引物在玉米10 条染色体上的定位
由表3 可知，56 条引物在42 份玉米自交系中扩增出的等位基因数为2～9。56 条引物的多态性信息量为0.43～0.86。umc1887 的多态性信息量最低，为0.43；
tip5 的多态性信息量最高，为0.86。在56 条引物中有47 条引物的多态性信息量高于0.60，表明本试验所用的引物是合格的。有效等位基因数为1.75～7.04，基因型多样性为0.62～2.83。该结果表明引物在42 份供试材料中基因变异较为丰富，多态性较高。
表3 56 条引物在42 份供试材料中的遗传信息
2.3 L239 与L7221 与其他自交系之间的遗传距离
根据56 条SSR 引物的分析结果，利用DPS软件计算L239 与L7221 与其他自交系间的遗传距离。
L239 与CA375 的遗传距离最近，为0.50；
L7221 与LX9801 和农大178 的遗传距离较近，分别为0.43 和0.56。
2.4 42 份供试种质资源的遗传多样性分析
利用统计分析软件DPS 分析42 份玉米自交系的遗传相似性，并绘成树状图。由图3 可知，L7221主要属于塘四平头群，与LX9801 的种质资源关系聚为一类，同时与农大178 的亲缘关系较近，猜测可能同时含有PN 血缘。而L239 主要与改良Reid 群的种质资源关系比较近，同时与含有热带血缘的铁7922 和齐205 以及含有本土血缘的郑22 聚为一类，说明L239 是以改良Reid 群为主导，同时含有热带血缘和本土基因。
图3 42 份玉米自交系树状图
研究现有玉米种质资源的遗传关系对正确认识我国玉米种质资源基础，提高其利用效率具有重要意义。目前，采用分子标记的方法来研究物种的亲缘关系和杂种优势普遍存在，RFLP、RAPD、SSR、AFLP得到了广泛的应用。MELCHINGER 等[19]采用RFLP分子标记的方法研究了划分玉米杂种优势群的可行性。SMITH 等[18]研究了利用SSR 和RFLP 标记对58 个玉米自交系的划群分析，表明两种划分结果高度相似并且与系谱分析基本吻合。本试验所选用的56 条SSR 引物是经过试验验证的，结果准确可靠。通过毛细管电泳检测的PCR 扩增数据时可以直接读出片段的大小，结果易于统计分析。
本试验通过对42 份玉米自交系进行分析，共检测到284 个等位基因变异，每56 条引物的等位基因数为2～9，多态性信息量为0.43～0.86，说明L239 等42 份材料间存在着丰富的遗传变异，同时也说明了本试验所用的56 条SSR 引物多态性高，毛细管电泳检测分辨率高，可以准确地鉴定出供试材料的遗传关系。这也进一步说明SSR 分子标记技术可以从分子水平上对系谱不清晰、血缘不明确的品种进行划分。
选育高配合力的杂种优势群，有利于提高我国玉米的产量。分析L239 与L7221 亲缘关系有利于预测玉米的杂种优势，对玉米的育种有很大影响。本试验结果表明，L7221 主要来源于塘四平头类群，说明其遗传背景丰富，不仅包括了塘四平头类群，还含有热带PN 类群的遗传背景，同时含有本土的遗传因素。由于PN 与国内4 大种质都有较高的配合力，组配的杂交种具有高产、优质、根系发达、耐旱、抗倒伏等优点，高抗多种病害，PN 种质得到广泛应用[20]。L239 主要属于改良Reid 群，同时融入了优良的热带种质资源的基因和本土优良基因。L239 与L7221杂优模式群主要为改良Reid 群×塘四平头群。正是由于获得的杂交种遗传背景丰富，才使其获得的玉米品种在黄淮海地区大面积推广。从L239 与L7221亲缘关系来看，符合黄淮海地区的主要杂种优势模式为改良Reid 群×塘四平头群。杂种优势群的确定，有利于提高玉米杂交的效率，从而选育出高产的玉米品种。
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