徐亦雯，张 诺，曹瑱艳，申屠旭萍，俞晓平
（中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，杭州 310018）
麦冬Ophiopogon japonicas为百合科沿阶草属植物，其作为我国传统浙八味中的一种，具有较高的药用价值。麦冬不仅可以作为疾病防治的治疗剂，也可以作为健康食品进行使用。麦冬在临床上以其干燥块根入药[1]，其主要成分包括甾体皂苷、高异黄酮和多糖等，具有保护心血管、抗炎、抗癌、抗氧化、免疫调节、止咳、抗菌和抗糖尿病等多种理化活性[2]。我国麦冬主要有浙江的浙麦冬和四川的川麦冬，而浙麦冬质量优于川麦冬[3]。统计显示，浙江省麦冬种植面积约为 6000多亩，亩产120公斤左右，年产量约为720吨[4]，主要应用于生产中成药如参麦注射液、生脉胶囊等，给浙江中药材产业带来了巨大的经济效益。随着对浙麦冬需求量的不断增长，浙麦冬的栽植量也日益扩增，随之而来产生了栽培技术不规范、病虫害发生频繁和农药使用不当等问题，对浙麦冬产量和品质产生了严重的影响[5]。
根据我们前期调研，黑斑病为浙麦冬主要病害之一，常发于5月中旬，6—7月为发病盛期。引起麦冬真菌病害的病原菌主要有尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum[6]、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[7]和链格孢菌Alternaria alternata[8]等。浙江省慈溪市是浙麦冬的主要种植基地，2019年5月在该基地发现麦冬植物叶片发生红褐色或黄色斑块，斑块渐渐扩大导致整个叶片枯死，其传染速度极为迅速，最终导致整株麦冬死亡，田间染病率可达40%，严重时可以高达70%及以上，其田间病害性状接近于麦冬黑斑病，但相关浙麦冬黑斑病病原菌及其防治的研究尚未见报道。因此，明确浙麦冬黑斑病的病原菌，建立有效防控技术，大大降低浙麦冬中黑斑病的发病率，对于浙麦冬产增产提质至关重要。
本研究对采集自慈溪浙麦冬种植基地的黑斑病病株进行病原菌分离、纯化以及柯赫法则验证，并利用形态学观察和分子序列比对明确其分类地位，进一步利用本实验室具有自主知识产权的淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物研究其对浙麦冬黑斑病的室内和田间防效，为浙江省慈溪市浙麦冬黑斑病的有效防治提供理论依据。
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 黑斑病病原菌来自于2018—2019年5—7月从浙江省慈溪市麦冬种植区采集具有典型黑斑病症的麦冬病株；
盆栽健康麦冬由浙江麦冬种植基地提供。淀粉酶产色链霉菌1628: 由浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室提供。
1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar, PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，蒸馏水1000 mL；
淀粉酶产色链霉菌1628发酵培养基（TPM）：可溶性淀粉2%，CaCO30.5%，KH2PO40.3%，NH4Cl 0.3%，FeCl20.1%，黄豆粉4.3%。
1.1.3 试剂与仪器 DNA提取试剂盒、EXTaq聚合酶、DNA marker（上海生工生物工程（上海）股份有限公司）；
CTAB提取液（北京索莱宝科技有限公司）；
无水乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
PCR仪，Sub-Cell GT核酸电泳仪，Gel Doc XR凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；
YS显微镜（日本尼康公司）；
MP Fast-prep-24均质仪（北京优尼康生物科技有限公司）；
Nanodrop2000蛋白核酸定量分析仪（美国Thermo公司）。
1.2 方法
1.2.1 病原真菌分离纯化 通过平板分离方法对病原菌进行分离纯化。用75%酒精棉球对浙麦冬带病组织进行擦拭，将患病组织处切成1.0 cm×1.0 cm的小块组织，浸泡于75%酒精中30 s，用1% NaClO表面消毒4 min，再用75 %的酒精清洗30 s除去表面残留的NaClO，无菌水漂洗3次，将组织水分吸干后置于PDA平板上，28 ℃培养7 d左右长出单菌落，挑取单菌落接种于新的PDA培养基上纯化，于28 ℃培养箱中恒温黑暗培养7～14 d后, 观察菌落形态和色素的产生情况等，最后将纯化菌的孢子用25%的甘油保存于-80 ℃冰箱备用[9]。
1.2.2 致病性测定 试验利用柯赫法则[10]对浙麦冬黑斑病病株上分离到的病原真菌进行致病性测定。将分离纯化后的病原真菌接种于PDA培养基上培养5 d，用无菌水冲洗菌落表面，稀释后制得浓度为1×106孢子/mL的孢子悬浮液。采用喷雾法进行接种，用金刚砂对健康植株叶片的表面进行摩擦，将孢子悬浮液喷洒在摩擦过的叶片上，用塑料膜将其罩住保湿48 h，无菌水作为对照。该试验在26 ℃、光照时间12L:12D、相对湿度60%的人工气候室中培养，每组设置3组重复。15 d后观察并记录喷雾孢子悬浮液与无菌水的植株染病及对比情况，并分离病变组织，病变组织分离步骤同1.2.1。对该组织进行鉴定比对是否与原始病原菌相同。
1.2.3 形态学鉴定 将纯化后的病原菌接种于PDA平板上，28 ℃培养7 d。观察其菌落生长速率、形态和颜色等。孢子形态观察：用无菌水将孢子冲洗过滤后取20 μL于玻片上在400倍显微镜下观察，记录孢子形态大小、有无横隔纵膈等。产孢链观察：将PDA平板直接置于200倍显微镜下观察其产孢链[11-13]。
1.2.4 病原真菌分子生物学鉴定 病原真菌DNA的提取：采用CATB法进行DNA的提取[14]，并使用基因EF-1α、RPB2、Alt a 1、His 3、ATP和ITS的引物（表1），扩增相应基因序列片段[15,16]。PCR反应总体积为 50 μL，ExTaq25 μL，上下游引物各 1.5 μL，DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 21.5 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性30 s，51 ℃～62 ℃退火温度30 s，72 ℃延伸45 s，共34个循环，最终72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至杭州有康生物有限公司进行测序，所获序列在NCBI上进行BLAST序列比对分析，通过MEGA X邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建发育树。
表1 本试验中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study
1.2.5 淀粉酶产色链霉菌 1628代谢产物对麦冬黑斑病的室内防效测定 淀粉酶产色链霉菌 1628于TPM培养基中发酵7 d制备其代谢产物溶液[17-19]。菌丝生长抑制测定：将淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物按体积比稀释成不同的浓度梯度（10%、1%、0.33%），用0.22 μm过滤器过滤后取2 mL加入到18 mL的PDA培养基中，将其混匀后倒平板。将直径为5 mm的浙麦冬黑斑病病原菌菌饼置于PDA平板中央，28 ℃培养5 d，用无菌水作为阴性对照，5%多菌灵作为阳性对照，每组3皿，试验重复3次。5 d后采用十字交叉法测定平板上菌落直径，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－5）×100。
1.2.6 淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物对浙麦冬黑斑病田间防效测定 试验用田面积约为16 m2。于2019年9月采集浙江省慈溪市麦冬种植基地的一年生健康麦冬植株，采集当天带回实验室进行栽培。2020年5月麦冬进入发病期，对病情进行记录并统计数据。将体积比为100%的淀粉酶产色链霉菌（1区）1628代谢产物和6.25%的淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物（2区）作为生物防治药剂于浙麦冬黑斑病高发期进行田间防效测定，并用清水作为阴性对照，50%多菌灵为阳性对照，且每块处理田之间用阴性对照作为间隔田，以免试验产生影响。采用手动压力式喷雾器对整株麦冬均匀喷洒不同供试剂，喷洒量为500 kg/hm2，每个分区样本量为30株。在7和14 d后分别调查发病情况，以每块分区施药前的发病情况为基础，对病情指数进行统计并校正防效。将发病情况分为4级：0级，健康苗；
1级，0～25%病株；
2级，26%～50%病株；
3级，51%～75%病株；
4级，76%～100%病株[20]。病情指数=∑（各级病株数×对应各级代表数值）/（调查总株数×发病最高级的代表数值）×100；
校正防效（%）=100×[1－（处理药后病指×对照药前病指）/（处理药前病指×对照药后病指）][21]。通将数据通过SPSS软件进行单因素方差分析，采用t-test进行差异显著性分析。
2.1 病害症状描述
该病原菌主要侵害浙麦冬叶片，发病初期病叶表面出现少量棕色斑点，发病中期叶片上斑点变多并不断扩大，后期染病部位从初期的棕色斑点变成不规则的形状，呈凹陷的红褐色病斑扩散至整株麦冬叶片，尖端叶片枯黄（图1A），最终导致叶片枯死进而引起整株麦冬死亡。根据发病特征将其鉴定为黑斑病[22]。
2.2 浙麦冬黑斑病病原真菌的致病性测定
对分离自浙麦冬上黑斑病的病原真菌（编号MD-1）进行致病性测定。7 d左右观察到初始发病症状与田间病原菌感染植株一致，叶片上出现少量棕色斑点，一周之后叶片上斑块不断扩大呈现红褐色凹陷的不规则形状，从叶片尖端逐渐扩散至根部（图1B，C）。从病株叶片感染处重新采集病原组织后再次分离纯化后得到的菌株与原始病原菌MD-1形态一致，说明经柯赫氏法则验证MD-1为引起浙麦冬黑斑病的病原菌。
图1 浙麦冬黑斑病的病害特征及致病性测定Fig.1 Disease characteristics and the pathogenicity assay of black spot in O.japonicas
2.3 浙麦冬黑斑病病原菌形态学鉴定
病原菌MD-1在PDA平板上呈放射状生长，初期菌丝呈现浅灰色，菌落逐渐向四周扩散，平板中心呈深灰色，周围由浅灰至白色散开，菌丝呈棉絮状覆盖在表面，平板背面颜色呈现黑色，周围一圈呈现灰白色，在28 ℃下培养14 d菌落直径为7.5 cm（图2A）。显微镜下单个孢子呈倒棒状或梨形，具有3～8个横隔，1～4个纵隔；
孢子大小约为（17.0～81.0）μm×（8.0～23.5）μm，部分孢子顶部含有假喙，大小约为（0～23.5）μm×（2.5～9.0）μm（图 2B，C）。菌丝有隔、细长型（图 2D，E），初步鉴定该病原真菌为链格孢菌A.alternata。
图2 MD-1菌落与孢子形态学观察Fig.2 The morphology of MD-1 colony and conidiospore
2.4 病原菌分子生物学鉴定
用特异性引物对病原菌MD-1进行分子鉴定，6个基因部分序列片段的电泳图如图3所示。将序列在NCBI上进行BLAST比对，发现ITS序列与Genbank中链格孢菌（登录号：MN245900.1）同源性为100%；
ALT a1序列与Genbank中链格孢菌（登录号：MN304714.1）同源性为100%；
RPB2与Genbank中链格孢菌（登录号：DQ677980.1）同源性为99.91%；
TEF-1α与Genbank中链格孢菌（登录号：MK637432.1）同源性为100%；
ATPase序列与Genbank中链格孢菌（登录号：MW541763.1）同源性为99.83%；
His 3序列与Genbank中链格孢菌（登录号：MK460236.1）同源性为99.77%；
结合形态学鉴定结果，确定该病原菌为链格孢菌A.alternata（图 4），并将序列上传至 NCBI获得登录号 ITS（MW989987）、ALT a1（MW995953）、RPB2（MW995956）、TEF-1α（MW995955）、ATPase（MW995957）、His 3（MW995954）。
图3 ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α、ATPase和His 3 PCR扩增产物的电泳分析图Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of ITS, ALT a1, RPB2, TEF-1α, ATPase and His 3 sequences
图4 基于ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α、ATPase和His 3序列构建MD-1相似菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of MD-1 based on ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α, ATPase and His 3 sequences
2.5 淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物对浙麦冬黑斑病菌抑制作用
菌丝生长抑制试验结果表明，淀粉酶产色链霉菌 1628代谢产物对浙麦冬黑斑病病原菌菌丝生长具有较好的抑制作用。其中10%的淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物对黑斑病病原菌菌丝生长抑制率高达98%。根据毒理学回归方程可得，当代谢产物浓度为0.764%时，其对菌丝的抑制效果仍达到50%（表2）。0.33%淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物对浙麦冬黑斑病菌的抑制效果显著高于5%的多菌灵。
表2 淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物对浙麦冬黑斑病病原菌菌丝生长的影响Table 2 Effects of Streptomyces diastatochromogenes 1628 metabolites on mycelial growth of the pathogen of O.japonicus black spot
2.6 田间防效测定结果
田间防效测定结果显示，100%的淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物对浙麦冬黑斑病具有较好的防治效果，7 d时校正防效可达74.08%，其防效高于50%浓度的淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物；
且50%的1628代谢产物和50%的多菌灵对浙麦冬黑斑病的田间防效无显著性差异。试验结果表明，7和14 d对于不同浓度的 1628代谢产物对病原菌防治效果都较为稳定，不同时间的防治效果在大多数情况下无显著性差异。且14 d时多菌灵对浙麦冬黑斑病的防治效果相较于7 d时的防治效果显著下降，由此表明，1628代谢产物对病原菌能持续稳定地抑制（表3）。
表3 供试杀菌剂对浙麦冬的田间防效Table 3 Control effects of fungicides on the O.japonicus
浙麦冬是一种具有较高价值的药食同源植物[23]，黑斑病作为浙麦冬上常见的病害在浙江省慈溪市麦冬种植基地发生，且其传染速度极快，严重时导致浙麦冬植株死亡可达总数的70%，影响浙麦冬的生长和产出。因此，明确鉴定浙麦冬黑斑病病原菌，并且找到有效安全的防治手段成为当前的主要任务。本文首先通过孢子与菌丝的形态初步鉴定出引起浙麦冬黑斑病的病原菌为链格孢属。由于链格孢菌形态较为多样复杂，在不同温度、光照等条件下其孢子形状大小、假喙、分隔数等也具有较大差异，给链格孢菌种的鉴定带来很大困难[24]。单纯使用真菌分类中的标记序列ITS无法对浙麦冬黑斑病病原真菌进行准确的种属鉴定。因此，利用TEF-1α、RPB2、Alt a1、His 3、ATP和ITS六个最为常见的链格孢菌特异性引物进行扩增，对链格孢小孢子种进行分类鉴定，从而更加准确地鉴定。对序列分析后鉴定出浙麦冬黑斑病病害的病原菌为链格孢菌。
目前，对于浙麦冬黑斑病有效的生物防治手段相对较少，化学防治作为主要的手段，容易导致吡虫啉、啶虫脒、福美双等化学农药滥用、病原菌产生抗药性等问题，不仅无法对病害进行有效防治还使得浙麦冬中农药残留超标，严重影响人们生命健康与安全。生物防治手段通过微生物及其代谢产物对病害进行防治，其毒性相对较低、对环境污染、残留较少，在植物病害防治中具有较为广阔的应用前景。本实验中的淀粉酶产色链霉菌 1628是一种效果较高的拮抗菌，其代谢产物主要包括核苷类抗生素和多烯大环内酯类抗生素。对于链格孢菌、镰刀菌等多种病原菌都具有较好的抑制作用[25]。通过菌丝生长速率法与田间防效测定结果显示，淀粉酶产色链霉菌1628代谢产物对浙麦冬黑斑病病原菌具有较好的抑制作用，100%的代谢产物对病原菌菌丝的抑制率高达近100%。根据校正防效数据显示，在14 d时100%和50%的淀粉酶产色链霉菌1628的校正防效分别为65.28%和59.62%，而50%的多菌灵在14 d的校正防效为51.28%，相较于多菌灵具有较强持久的抑制效果。在后续田间防效试验结果中显示，淀粉酶产色链霉菌 1628代谢产物相较于多菌灵对浙麦冬黑斑病的防治效果更好更稳定。因此，淀粉酶产色链霉菌 1628代谢产物可以作为浙麦冬黑斑病较好的生物防治剂。
相关浙麦冬黑斑病病原菌的研究报道较少，本论文开展浙麦冬黑斑病病原菌分离鉴定研究，并为后续该病害的生物防治提供依据。从而为浙江慈溪浙麦冬种植基地常发的黑斑病更有效生物防治与低残留、优生态提供依据，保障浙麦冬产量和质量。
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