黄翠燕，余凯健，廖燕玲，高炳淼
(1 海南医学院第一附属医院药学部，海南 海口 570102；
2 海南医学院热带转化医学教育部重点实验室药学院，海南 海口 571199)
沙虫，又称方星格虫(Sipunculusnudus)，隶属于星虫动物门，方格星虫纲。全身由吻与躯干两部分组成，呈圆筒状，全身光裸，体壁厚，纵横肌层均分割为肌束，呈带状以致使体表出现方格状。沙虫广泛分布于大西洋、太平洋、印度洋、地中海、红海和加勒比海等海域。全世界共有11种，其中我国有5种，主要分布于东南沿海[1-5]。沙虫具有丰富的营养物质，民间称其为“海洋冬虫夏草”“动物人参”，古籍中记载沙虫具有性寒、味甘，具有滋阴补阳、清肺降火、活血保健等功效,可用于抗氧化、抗病毒活性、抗疲劳、提高免疫力及促进伤口愈合等[6-12]。
近年来，通过实验研究发现，沙虫蛋白质经酶促水解后产生具有抗氧化、调节人体机能的生物活性小肽，能够通过清除体内自由基而成为副作用小且易于吸收的天然抗氧化剂[13-18]。本实验采用沙虫为实验材料，采用水提法提取沙虫总蛋白，对沙虫酶解多肽的制备工艺进行优化，通过DPPH·自由基清除的实验验证其抗氧化活性，以期为沙虫的进一步开发利用奠定基础。
1.1 材料与试剂
沙虫采集于海南省儋州市光村镇，其形似长筒，如肠子一般，体长约12～19 cm；
中性蛋白酶(Dispase S10013)、木瓜蛋白酶(Papain YY10509)、胃蛋白酶(S10027)，上海源叶生物科技有限公司；
碱性蛋白酶(01-186)，北京奥博星有限公司；
蛋白 Marker，江苏楚瑞生物科技有限公司；
BCA法蛋白含量测定试剂盒(BL521A)、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒，白鲨生物科技有限公司；
RIPA裂解液、PMSF溶液，北京普利来基因技术有限公司；
DPPH·自由基清除能力试剂盒，南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器及设备
FW100型高速粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；
DYCZ-24DH型垂直蛋白电泳仪，北京六一生物科技有限公司；
SynergyHTX多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司;FD-A10N冷冻真空干燥机，冠森生物科技上海公司；
Tanon 6600全自动化学发光图像分析系统，上海天能科技有限公司。
2.1 总蛋白的提取
取新鲜沙虫，解剖后清洗去泥沙，排列于托盘，50 ℃干燥24 h后，粉碎至粉末，装入密封袋于冰箱冷藏保存。取2 g粉末溶于60 mL去离子水中超声处理后加500 μL裂解液和5 μL PMSF搅拌使充分混匀，放至4 ℃冰箱24 h，离心取上清液，冷冻干燥成粉，保存至-20 ℃冰箱备用。
2.2 总蛋白浓度测定及SDS-PAGE分析
配制BSA标准品和待测样品，加入96孔板内，在每孔加入BCA工作液，37 ℃反应30 min，在562 nm处测吸光度，测定总蛋白含量。取10 μL 2×Loading Buffer缓冲液与10 μL总蛋白提取物混合均匀，放置于水浴锅中100 ℃煮沸5 min，1000 r/min离心3 min后取上清液，电泳约3.5 h后，R-250染色液染色过夜，再进行脱色，脱至底胶蓝色消失后用凝胶成像系统扫描照相并记录电泳的结果。
2.3 酶种类对总蛋白水解度的影响
称取沙虫总蛋白冻干粉若干份，在一定加酶量的条件下，分别制备木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解液，分析并比较水解效果的优劣。制备条件见表1。
表1 四种蛋白酶活性的最适条件Table 1 The optimum conditions for the activity of four proteases
2.4 单因素实验
2.4.1 pH对沙虫蛋白水解度的影响
分别称取沙虫蛋白冻干粉0.1 g，称取0.5 mg酶为底物，在料液比为1:20的条件下，探究pH条件为5～9，50 ℃酶解4 h后，10000 r/min离心3 min后，取上清液过滤，使用BCA法测定其吸光度，计算出多肽含量及水解度。
在图3中，固定f=0.2,可以清楚看到，ER网络在HTLDD、LTHDD和RDD策略下具有相似的鲁棒性，表明不同的边定向策略对ER网络抵制级联故障的鲁棒性影响不大.
2.4.2 温度对沙虫蛋白水解度的影响
在pH为7的条件下，其他实验步骤与2.4.1一致，探究酶解温度40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，测定多肽含量及水解度。
2.4.3 时间对沙虫蛋白水解度的影响
在pH为7，酶解温度50 ℃下，其他实验步骤与2.4.2一致，探究酶解时间为2～6 h时，测定多肽含量及水解度。
2.4.4 E/S对沙虫蛋白水解度的影响
在pH为7，酶解温度50 ℃，酶解时间为3 h的条件下，探究E/S为4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%和12%时，测定多肽含量及水解度。
2.5 正交实验优化
基于上述单因素实验，选择酶解pH(A)、温度(B)、时间(C)、加酶量(D)四个因素，每四个因素做三个水平，以蛋白水解率作为指标，进行正交实验探究中性蛋白酶酶解沙虫总蛋白的最佳水解条件。如表2所示设计正交实验。
表2 正交试验因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal test
2.6 清除自由基实验[19]
DPPH工作液粉剂加入40 mL无水乙醇制备后避光保存，分别取400 μL样品和600 μL工作液混匀避光反应30 min，4000 r/min离心5 min后，在波长为517 nm测定吸光度值。空白组以80%的甲醇溶液代替样品，设三个平行组。以不同浓度梯度(50 mg/mL、40 mg/mL、30 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL)的酶解多肽探究DPPH·清除率与酶解多肽浓度的关系。
3.1 沙虫总蛋白提取及含量测定
图1 沙虫总蛋白的电泳分析Fig.1 Electrophoretic analysis of total protein of Sipunculus nudus
3.2 蛋白酶种类对沙虫总蛋白酶解的影响
通过SDS-PAGE电泳及BCA法测定胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解产物的水解度，以测定酶的活性。电泳结果表明杀虫总蛋均能被四种蛋白酶酶解，无显示明显的差异。再通过BCA法测定，结果如表3所示，中性蛋白酶的酶解能力最强，其次是碱蛋白酶。因此，选用中性蛋白酶进行单因素实验及正交实验。
表3 四种不同蛋白酶对沙虫总蛋白的水解效果Table 3 Hydrolysis of Sipunculus nudus total protein by four different proteases
3.3 单因素实验条件优化
3.3.1 pH对沙虫蛋白水解度的影响
实验探究了酶解pH从5.0～9.0之间蛋白水解度的情况。在pH 5.0～9.0之间，蛋白水解度先上升后下降，当pH为6时，沙虫蛋白水解度达到最高值，因此，最佳酶解pH为6。随着pH增大，酶的活性受到影响，水解度明显下降(如图2所示)。
图2 pH对沙虫总蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis of total protein of Sipunculus nudus
3.3.2 酶解温度对沙虫总蛋白水解度的影响
实验在其他条件相同时，探究酶解温度在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃时，蛋白水解度的情况。沙虫蛋白水解度首先迅速上升后缓慢降低，整体变化幅度大，当酶解温度达到45 ℃时，沙虫蛋白水解度达到最大，如图3所示。因此，最佳酶解温度为45 ℃。
图3 酶解温度对沙虫总蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis degree of total protein of Sipunculus nudus
3.3.3 酶解时间对沙虫蛋白水解度的影响
实验在其他条件相同时，探究酶解时间从2.0～6.0 h之间，沙虫蛋白水解度的情况，2.0～5.0 h之间，蛋白水解度在不断的升高，但在酶解时间达到4 h时，蛋白水解度达到最高。之后随着酶解时间增加开始降低。可能随着时间的延长，酶解蛋白受到一些因素影响，水解度下降，如图4所示，胃蛋白酶的最佳酶解时间为4 h。
图4 酶解时间对沙虫总蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on hydrolysis degree oftotal protein of Sipunculus nudus
3.3.4 加酶量对沙虫蛋白水解度的影响
实验在其他条件相同时，探究E/S在4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%和12%时，沙虫酶解蛋白水解度的情况。如图5所示，酶解蛋白的水解度随着加酶量的增加呈现先增后减的趋势，当E/S为4%时，沙虫蛋白水解度达到最大值，继续增加酶量，水解度反而下降。实验结果为正交试验提供了酶与底物比例的参考范围。
图5 加酶量对沙虫总蛋白水解度的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of total protein of Sipunculus nudus
3.4 正交试验优化结果
选用胃蛋白酶，在pH为5、6和7、酶解温度为45 ℃、50 ℃和55 ℃，酶解时间为3 h、4 h和5 h、E/S(%)为7%、8%和9%的条件下，进行正交实验，结果如下表4所示，最佳水平的组合为A1B2C2D2，即中性蛋白酶酶解沙虫总蛋白的最适条件为：pH为5，E/S为8%，酶解温度为50 ℃，酶解时间为4 h。在最佳酶解条件下，沙虫蛋白的水解度达到了86.1%。
表4 正交试验结果及分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test
续表4
3.5 DPPH·自由基清除实验结果
DPPH·自由基试剂与乙醇溶液混合后呈现成紫色，在波长为517 nm处有特征吸收峰，可用于验证抗氧能力[20]。如图6所示，酶解样品的清除率均比未酶解样品高，其最高值为6号样品，清除率达到44.64%，其酶解条件为pH为6、E/S为8%、酶解温度为45 ℃、酶解时间为4 h。通过大量制备实验发现，沙虫的清除能力与沙虫蛋白浓度成正相关，随着沙虫样品浓度的不断增大(如图7所示)，DPPH·自由基清除率增大。
图6 沙虫样品对DPPH的清除能力Fig.6 DPPH scavenging ability of Sipunculus nudus samples
图7 不同浓度梯度样品对DPPH·自由基清除的效果Fig.7 DPPH · radical scavenging ability of samples with different concentrations
海洋生物沙虫除了食用的风味独特之外，具有抗氧化、抗病毒活性等多种药理活性[21-22]。本研究以沙虫为原料，采用加裂解液法提取沙虫总蛋白，通过中性蛋白酶酶解沙虫总蛋白，以其蛋白水解度及DPPH·自由基清除率为指标，对酶解条件进行单因素实验和正交实验，得到最佳酶解条件为：pH为5，E/S为8%，酶解温度为50 ℃，酶解时间为4 h。清除自由基活性实验结果表明，沙虫酶解多肽的浓度越高，DPPH·自由基清除率效果越好。本研究表明采用优化的酶解工艺条件制备的沙虫酶解多肽具有显著的清除自由基活性，为沙虫酶解多肽的大规模生产及开发应用提供理论依据。
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