黄水金，徐 晖，林 璐，范佐旺，柯晓燕
(1 三明医学科技职业学院，福建 三明 365000；
2 江西中医药大学，江西 南昌 330004；
3 三明市中西医结合医院，福建 三明 365000)
黄芩为唇形科黄芩属多年生草本植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，又名土金茶根、山茶根,始记于《神农本草经》[1]，15版药典记录黄芩味苦，性寒，具有泻火解毒、清热燥湿、止血、安胎等多种功效。主要用于湿温、暑湿、湿热痞满，湿热黄疸，肺热咳嗽，肺炎、胸闷、呕恶，泻痢，高热烦渴，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安等症[2]。黄芩中含有黄酮类、酚苷、醇苷、挥发油、微量元素、氨基酸等成分,其中黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷等黄酮类成分是其主要药效成分，众多研究表明黄芩的提取物中主要化合物为黄酮类化合物，黄芩苷和黄芩素具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗过敏、抗疲劳、保护心脑血管等多方面的药理活性[3-9]，其中抗细菌、真菌方面的作用尤为显著。施高翔等[10]在研究中表明黄芩对大肠杆菌、葡萄球菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌、白色念珠菌等多种细菌和真菌有显著的抑制作用。黄芩在我国分布广泛,野生黄芩广泛分布于华北、东北、华中和西北等地区的12个省市，主产于河北、甘肃、山西、内蒙和东北三省等地[11]。众多研究表明不同产地黄芩主要化学成分含量存在较大的差异[12-14]，为更直观的观察不同产地黄芩在抗细菌、真菌效果方面的差异，本实验选取河北、山西、内蒙、陕西，甘肃五个代表性产地的黄芩进行体外抑菌试验。通过实验测定不同产地黄芩的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度，分析抑菌效果差异，为后续黄芩的开发应用奠定实验基础。
1.1 仪 器
JD200-4电子天平，沈阳市多杰电子科技有限公司；
DHG-9140A电热鼓风干燥箱，山东博科生物产业有限公司；
FS-2000T超声波提取器，上海生析超声仪器有限公司；
98-1-B电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；
RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；
SHZ-III循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；
HH-s4恒温水浴锅，江阴市保利科研器械有限公司；
UV-3200紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；
LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；
SW-CJ-2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
DNP-9272BS-Ⅲ恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；
SPH-200D恒温摇床，上海世平实验设备有限公司;BSC-1500IIA2-X生物安全柜，山东博科生物产业有限公司。
1.2 菌 株
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均由三明医学科技职业学院病原微生物实验室提供。
1.3 药材与试剂
河北黄芩购于康美药业股份有限公司；
山西黄芩购于山西振东道地药材开发有限公司；
内蒙古黄芩购于豪州市康易饮生物科技有限公司；
陕西黄芩购于康佰家大药房；
甘肃黄芩购于玉林市文药堂商贸有限公司，以上饮片均符合药典要求。
黄芩苷标准品(批号：110715-202122),中国食品药品检定研究院；
无水乙醇，AR级(批号：20220316),国药集团化学试剂有限公司；
营养肉汤琼脂(批号：200802),杭州滨河微生物试剂有限公司；
MH肉汤(批号：220315),杭州滨河微生物试剂有限公司。
2.1 供试品的准备
取河北、山西、内蒙、陕西,甘肃黄芩饮片烘干至恒重,粉碎过二号筛。分别称取黄芩粗粉10 g，置于1～5号烧杯中，加入10倍量75%乙醇，40 ℃超声提取1 h，滤过，滤渣加5倍量75%乙醇再次超声提取1 h，合并两次滤液，使用旋转蒸发仪浓缩得到浸膏，烘干残余溶剂，加纯化水超声溶解后定容至10 mL，即得浓度为1 g/mL黄芩不同溶剂提取液供试品。
2.2 黄芩苷含量的测定
对照品置于烘箱中60 ℃烘干至恒重，称取9.93 mg以75%乙醇为溶剂溶解定容至50 mL，移液管移取1 mL加75%乙醇定容至10 mL即得浓度为19.86 μg/mL的黄芩苷标准储备液。分别移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL黄芩苷标准储备液，75%乙醇定容至10 mL，采用分光光度法[17]在278 nm波长处紫外分光光度计测定吸光度,建立标准曲线。以75%乙醇为溶剂将2.1中供试品溶液稀释成25 μg/mL，0.45 μm滤头过滤后滤液为样品溶液，测定吸光度值，计算供试品黄芩苷百分含量。
2.3 菌悬液的制备
称取27 g MH肉汤粉末，加纯化水1000 mL，加热煮沸至完全溶解，取3个洁净的100 mL洁净锥形瓶编号，各加入50 mL配置好的MH肉汤，塞好硅胶塞，置于高压灭菌锅121 ℃高压灭菌15 min。随后置于恒温培养箱中37 ℃培养24 h，确定无细菌生长。在3个100 mL锥形瓶中分别接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌，置于恒温摇床37 ℃,转速60 rmp恒温培养18 h即得金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌菌悬液。
2.4 倍半稀释法稀释药液
以配置好的MH肉汤为溶剂将2.2中的五个供试品逐步稀释成100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL、0.78 mg/mL八个浓度，取洁净试管，编号，摆放好，每个试管分装2 mL上述稀释好的供试品溶液，由于选取了三种菌每种平行做3份，故每个浓度分装9份。另取12支洁净试管分别加入2 mL MH肉汤，其中9支作为阳性对照，3支作为阴性对照。将上述装有药液的试管置于高压灭菌锅中121 ℃高压灭菌20 min，备用。
2.5 琼脂平板的制备
称取营养琼脂培养基76 g，加蒸馏水2000 mL，加热溶解，分装于6个500 mL锥形瓶中，将分装锥形瓶置于121 ℃高压灭菌15 min。在洁净工作台内取出趁热倒于经高压灭菌的培养皿内，厚度约4 mm。盖好水平放于洁净工作台使琼脂冷却凝固。待凝固后的培养皿放于恒温培养箱37 ℃培养24 h，确定无细菌生长。放于3～5 ℃冰箱备用。
2.6 抑菌试验
在生物安全柜内给2.4中编好号的试管内使用无菌枪头加入对应菌悬液30 μL。9支阳性对照编好号分为三组，分别加入三种菌悬液，3支阴性对照不加菌悬液，置于恒温摇床培养箱37 ℃，转速60 rmp,恒温培养24 h。由于药液有一定浑浊度不便观察细菌生长情况，为更直观的观察结果将上述试管的液体使用灭菌的接种环取一环涂布于对应的培养皿，恒温培养箱37 ℃培养18 h，对比空白组观察，并记录最小抑菌浓度。
3.1 黄芩苷含量的测定
表1 不同浓度黄芩苷标准品溶液吸光度Table 1 Absorbance of baicalin standard solutions at different concentrations
图1 黄芩苷标准曲线Fig.1 Standard curve of baicalin
通过分光光度法按2.2中方法建立标准曲线，标准曲线经线性回归，回归方程为y=0.0598x+0.0067，R2=0.9995(结果见表1，标准曲线见图1)。供试品稀释至25 μg/mL，0.45 μm滤头滤过，在278 nm波长处紫外分光光度计测定吸光度，计算黄芩苷百分含量(详见表2)，结果显示黄芩苷含量均符合药典要求。
表2 不同产地黄芩苷含量(n=3)Table 2 Baicalin content in different origins (n=3)
3.2 体外抑菌试验
河北、山西、内蒙、陕西、甘肃所产黄芩醇提浸膏对金黄色葡萄球菌的MIC依次是3.125、6.25、3.125、12.50、6.25 mg/mL；
对大肠杆菌的MIC依次是6.25、12.50、6.25、12.50、25.00 mg/mL；
对白色念珠菌的MIC依次是6.25、6.25、3.125、12.50、3.125 mg/mL。研究发现河北、山西、内蒙、陕西、甘肃所产黄芩提取液均对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌有明显的抑菌效果。其中，河北、内蒙黄芩提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌效果最强，内蒙、甘肃黄芩提取物对白色念珠菌抑菌效果最强，详见表3。
表3 不同产地黄芩提取物MIC(n=3)Table 3 MIC extracts of scutellaria baicalensis from different origins (n=3)
黄芩中含有黄酮类、酚苷、醇苷、挥发油、微量元素、氨基酸等成分。任正肖等[15]在研究中表明黄芩的主要活性成分是黄酮类化合物。黄芩黄酮类化合物中黄芩苷被认为是其主要有效成分。黄芩苷能抑制大肠杆菌的活性，能增加菌液的电导率和大肠杆菌内碱性磷酸酶的含量，通过增加菌体细胞膜和细胞壁的通透性，从而起到抑菌的作用[16]。黄芩苷可通过抑制白念珠菌的DNA、RNA、蛋白质的合成导致白色念珠菌细胞死亡[18]。黄芩苷可能通过抑制α-溶血素的活性而降低肺部金黄色葡萄球菌的细菌量[19]。众多研究表明黄芩提取物对细菌的抑制作用与其黄芩苷的浓度密切相关。黄芩苷提取率直接影响黄芩的抑菌效果.黄芩苷的水溶性与脂溶性均较低[20-21]，王娜[7]在研究中提到黄芩苷有一定的脂溶性，易溶于醇，因此醇提法提取率比水提法高，本实验选取75%乙醇作为提取溶剂。关崇新[22]在研究中对比超声提取法与浸渍法对黄芩中总黄酮的提取率，通过实验证实超声提取法优于浸渍法，为提高黄芩苷提取率本实验采用超声提取法提取。黄芩在我国分布范围广泛，不同地区的黄芩有不同程度的抑菌效果。本实验采用75%乙醇提取河北、山西、内蒙、陕西、甘肃五个代表性产地所产黄芩，选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌进行体外抑菌试验得出最小抑菌浓度。黄芩苷含量测定及抑菌实验结果与文献查阅的不同产地黄芩苷的含量测定研究结果基本吻合。黄芩具有抑菌效果显著、资源丰富等优势，本实验开展不同产地黄芩体外抑菌试验研究，为后续黄芩的开发应用提供了实验基础。
本实验选取河北、山西、内蒙、陕西、甘肃五个代表性产地所产的黄芩进行体外抑菌试验研究。结果表明，五个不同产地的黄芩提取物均有显著的抑菌效果。河北、内蒙黄芩提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌效果最强，内蒙、甘肃黄芩提取物对白色念珠菌抑菌效果最强。
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