俞伶俐，魏升华，罗法院，文琴琴，严福林
(贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025)
朱砂根(ArdisiacrenataSims)是紫金牛科紫金牛属的常绿灌木，又名富贵籽[1]，其根部是贵州重要的道地特色民族药材“八爪金龙”的主要来源，具有解毒消肿、活血止痛、祛风除湿等功效，用于治疗咽喉肿痛、风湿痹痛、跌打损伤等疾病[2]。除了药用外，由于其果实红色，果期长，观赏价值好，具有重要的园艺价值。
种子萌发是植物个体繁殖发育形成的一种复杂而重要的生物特性，成熟种子通常在适宜的环境及物质信号的作用下开始新的生长周期[3]。植物激素是一种独特的微量信号分子，其浓度和平衡关系控制了植物在各个阶段的发育，对植物种子的萌发起着关键性作用。外源激素处理法已成为探索种子萌发等调控机理的有效方法[4]。例如，吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)主要作用于细胞分裂和扩张、细胞伸长和分化、细胞和组织的形态建成等；
赤霉素(Gibberellin，GA)能有效地促进细胞分裂和伸长、种子萌发及胚根和胚轴伸长生长等；
6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)主要作用于细胞分裂并诱导细胞体积横向扩大[5]。
近年来，由于对朱砂根研究的深入及相关产品的开发，使得其市场对朱砂根药材的需求逐年剧增，加上药农的不规范的采集，使得朱砂根资源急剧下降，一些地区已难觅踪迹。因此，开展人工引种栽培，尤其是以药材为主的规范化、规模化栽培迫在眉睫。然而，种子种苗繁育是引种驯化成功的重要标志，也是中药材民族药材可持续利用、规范化、规模化生产的物质基础。基于此，本研究通过探究不同外源激素对朱砂根种子生理成分的影响，探寻促进朱砂根种子萌发的适宜激素及其水平，以提高朱砂根种子的萌发率，为朱砂根的人工种植奠定基础。
1.1 供试材料
供试种子收集于贵州省黔东南州施秉县、雷山县等地，凭证标本均由贵州中医药大学中药栽培教研室魏升华教授鉴定，为紫金牛科朱砂根(ArdisiacrenataSims)，种子样品及凭证标本存放于贵州中医药大学中药材采收加工研究所。
1.2 实验试剂
赤霉素(批号：S18001)、萘乙酸(CAS号：86-87-3)、细胞分裂素(批号：S18017)、蒽酮(批号：S19210)、磷酸二氢钠(西陇化工股份有限公司)、乙酸乙酯(上海申博化工有限公司)等。
1.3 试验方法
种子前处理：对收集的朱砂根种子进行去皮，晾干。随机抽取种子样品，应用5 g/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)对种子进行避光染色30 min，检测种子的生活力。
1.3.1 时间考查
随机选取种子54 g，用水浸泡：6 h、12 h、24 h、36 h、48 h为处理组，以未浸泡的种子为空白对照组，每组3 g，重复3次，测定其活性蛋白质、可溶性糖、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。
1.3.2 浓度考查
随机选取种子60 g，处理组设置赤霉素的浓度为20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L，萘乙酸和细胞分裂素的浓度为100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L，分别浸泡24 h，纯水浸泡24 h为空白对照组。分别测定其活性蛋白质和可溶性糖的含量，过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
1.3.3 正交试验
根据单因素实验考察的结果，筛选出合适的浸泡时间、激素浓度及激素种类，然后进行L9(33)3因素3水平考察，筛选出朱砂根种子萌发的最佳方法。
1.3.4 指标测量方法
超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)显色法测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚比色法测定。可溶性糖含量采用蒽酮比色法于630 nm波长下测定[6]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法于620 nm波长下测定[7]。每组试验均重复3次。
1.3.5 数据处理与分析
2.1 浸种时间对朱砂根种子生理成分的影响
影响种子发芽的最重要因素为种子水分，尤其是休眠状态下的种子对水分含量的要求更为苛刻。由表1可知，浸泡时间对朱砂根种子生理指标的影响呈上升-下降趋势，活性蛋白质的含量：24 h>12 h>6 h>0 h>6 h>48 h，可溶性糖含量：24 h>12 h>36 h>6 h>48 h>0 h，过氧化氢酶活性：24 h>48 h=36 h=6 h=0 h>12 h，超氧化物歧化酶活性：24 h>48 h>36 h=12 h=6 h=0 h，浸泡24 h时的生理成分指标相对较高；
处理组和对照组比较，浸泡24 h后可溶性糖含量增加了54.95%，过氧化氢酶活性增加了50%，超氧化物歧化酶活性增加了45.56%，活性蛋白质含量增加了3.06%。
浸泡时间对4种生理指标的含量均有影响，但浸泡时间超过36 h会降低活性蛋白质的含量。浸泡24 h后可溶性糖和活性蛋白含量达到最大值，随着浸泡时间的延长，可溶性糖和活性蛋白含量呈下降趋势；
超氧化物歧化酶在浸泡24 h后酶活性达到最大值，之后随着浸泡时间的延长，酶活性降低。方差分析结果表明，浸泡时间对4种生理成分的影响具有显著性差异(P<0.05)。经综合分析，本研究选择24 h为朱砂根种子的浸种时间。
表1 浸泡时间对朱砂根种子生理活性物质含量的影响(mg/L，x±σ)
2.2 外源激素对朱砂根种子生理指标的影响
2.2.1 GA对朱砂根种子生理活性物质的影响
对朱砂根种子分别用20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L浓度的GA进行浸种24 h，测定各生理指标情况。由表2可知，活性蛋白质和可溶性糖随着GA浓度的升高呈先上升后下降趋势，在GA浓度为50 mg/L时达到最高，活性蛋白质含量增加了9.06%，可溶性糖含量增加了22.66%；
过氧化物酶和超氧化物歧化酶随着GA浓度的升高呈先下降后上升趋势，超氧化物歧化酶含量降低了11.27%，过氧化物酶的含量降低了66.67%。分析结果表明，GA浓度对4种生理指标影响显著(P<0.05)。综合得出GA处理浓度为50 mg/L时，各指标综合较高。
2.2.2 NAA对朱砂根种子生理活性物质的影响
对朱砂根种子分别用100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L浓度的NAA进行浸种24 h，测定各生理指标情况。由表3可以看出，NAA不同浓度对活性蛋白质、可溶性糖和超氧化物歧化酶含量与对照组比较均有显著性影响，NAA能提高可溶性糖、活性蛋白含量和超氧化物歧化酶的活性，当NAA浓度为250 mg/L时，可溶性糖和活性蛋白含量均达到最大值，当NAA浓度为300 mg/L时，超氧化物歧化酶含量均达到最大值；
分析结果表明，NAA浓度对4种生理指标影响显著(P<0.05)。根据生理指标含量，综合得出NAA处理的最佳浓度为250 mg/L。
表2 GA浓度对朱砂根种子生理活性物质含量的影响(mg/L，x±σ)
表3 不同浓度NAA对朱砂根种子生理活性物质含量的影响(mg/L，x±σ)
2.2.3 6-BA对朱砂根种子生理活性物质的影响
对朱砂根种子分别用100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L浓度的6-BA进行浸种24 h，测定各生理指标情况。由表4可以看出，活性蛋白质、可溶性糖的含量随着6-BA浓度的升高呈上升-下降的趋势；
过氧化物酶活性随着6-BA浓度的升高呈升高-下降-升高的趋势；
超氧化物歧化酶活性随着6-BA浓度的升高呈下降-升高的趋势。6-BA可提高活性蛋白质、可溶性糖的含量，分别提高了19.93%、43.97%，可降低超氧化物歧化酶的活性。方差分析结果表明，6-BA浓度对4种生理标影响显著(P<0.05)。根据生理指标含量，综合得出6-BA处理的最佳浓度为250 mg/L。
表4 不同浓度6-BA对朱砂根种子生理活性物质含量的影响(mg/L，x±σ)
2.3 正交实验
对不同因素水平处理后，试验组呈现的结果如表5所示，不同种类、不同浓度的外源激素和处理时间都对朱砂根种子生理指标的含量有着不同程度的影响。用50 mg/L GA处理36 h，其活性蛋白质和可溶性糖含量最高；
用200 mg/L NAA处理48 h，其过氧化物酶活性最高；
用60 mg/L GA处理48 h，其超氧化物歧化酶活性最高。分析结果表明，9种组合对活性蛋白质、可溶性糖、过氧化物酶、超氧化物歧化酶均有显著影响(P<0.05)。
表5 正交实验方案及结果
种子萌发是其所需要的适宜温度、水分和光照等环境因子诱导相关基因表达，从而引发一系列生理物质的反应，该过程可通过外源激素浸种等方法加以促进。本实验首先采用单因素考查，通过设置不同梯度的浓度和不同处理时间，探究出不同种类的激素的最适合处理浓度与最佳浸泡时间，得出朱砂根种子的最佳的浸泡时间为24 h。发现分别用50 mg/L GA、250 mg/L NAA、250 mg/L 6-BA处理的朱砂根种子，其活性蛋白质和可溶性糖含量最高。可溶性糖是种子萌发的呼吸底物，作为能量来源被逐渐分解[8]。蛋白质是构成部分细胞结构的基础物质，也是种子中氮元素的主要贮藏形式。可溶性蛋白起到提供氮素的重要作用，也为种胚的生长提供物质能量来源[9-10]，活性蛋白质和可溶性糖含量的提高可能会促进种子萌发。GA的最佳浓度为50 mg/L，这与曾双的研究50 mg/L GA显著的提高了西葫芦种子发芽势和发芽率一致。
在P<0.05水平下，3种激素对种子的活性蛋白质、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶活性有显著影响，且这3种激素的各个浓度都能提高种子的活性蛋白质、可溶性糖含量，促进种子的萌发。余春和等[12]发现中浓度NAA和6-BA处理对光皮桦种子的萌发有不同程度的促进作用。杜京旗[13]发现6-BA具有促进燕麦种子萌发和幼苗生长的作用。肖杰等[14]研究发现 GA和NAA均能显著提高3个紫薇品种种子发芽势。赵欢蕊等[15]发现GA3和NAA对黄秋葵种子的萌发具有一定的促进作用。这些发现与实验结果一致。
在正交实验中发现用50 mg/L GA处理朱砂根种子36 h，其活性蛋白质和可溶性糖含量最高；
用60 mg/L GA处理朱砂根种子48 h，其超氧化物歧化酶含量最高；
用200 mg/L NAA处理48 h，其过氧化物酶含量最高。综合考虑，50 mg/L GA处理朱砂根种子36 h，最大的提高了4种生理生化指标，是朱砂根种子的最佳处理方式。综上所述，GA、NAA、6-BA对朱砂根种子的生理生化有影响，可能促进朱砂根种子的萌发，本次实验为提高朱砂根种子萌发提供了一定的理论参考。