马卓然，林娜
(1. 右江民族医学院，广西 百色 533000；
2. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)
支气管哮喘是儿童常见的慢性呼吸道疾病。《2022年全球哮喘防治指南(GINA)》[1]认为哮喘是一种以慢性气道炎症、可变呼气气流受限为特征的特异质疾病。长期发病可导致气道重构。哮喘的发病不仅与年龄、性别、环境等因素有关，还与基因多态性有关[2]。2006年，OBER C等[3]在对人全基因组进行分析后发现超过25种基因多态性，如：β肾上腺素受体(ADRB2)基因、IgE高亲和力受体(FCER1B)基因、白细胞介素4受体(IL-4R)等可能与哮喘的发病相关。哮喘发病的不定时性、气道重塑的难逆转性，严重影响患儿的生活。儿童哮喘的有效预防也成为哮喘疾病研究的新热点。2009年上海交通大学华丽等[4]提出的9位点[FCER1B rs1441586(C-109T)、FCER1B rs5-69108(E237G)；
ADRB2 rs1042713(R16G)；
IL-4R rs1801275(Q551R)、IL-4R rs1805010(I75V)；
IL-4R rs2243250(C-590T)；
IL-13 rs1295686(C1923T)、IL-13 rs20541(A2044G)、IL-13 rs1800925(C-1112T)]构成的汉族儿童哮喘易感基因预测模型，对汉族儿童有较好的预测效能。本研究选取汉族儿童哮喘易感基因预测模型中的5个位点，验证所选位点与广西壮族儿童哮喘发生的相关性，旨在筛选广西壮族儿童哮喘易感基因预测模型适合位点，扩大汉族儿童易感基因预测模型的适用范围，为壮族儿童哮喘预防提供依据。
1.1 一般资料
1.1.1 哮喘病例组 选取2021年1月至2021年9月就诊于右江民族医学院附属医院呼吸科的100例确诊哮喘患儿为哮喘病例组。其中男71例，女29例，年龄1～11岁，平均(4.36±2.15)岁。纳入标准：①符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》；
②入院前2周内未使用抗生素、激素、平喘等药物。排除标准：①患有喉炎、毛细支气管炎、气道器质性病变(如：狭窄、软化、畸形等)、气道异物等；
②合并肺部疾病、心脏病、免疫系统疾病等；
③长期或近期服用免疫调节剂；
④尚不能确诊哮喘的其他喘息性疾病。
1.1.2 健康对照组 选取同期右江民族医学院附属医院体检中心的100例正常儿童为健康对照组。其中男62例，女38例，年龄1～12岁，平均(4.29±2.72)岁。纳入标准：①截至目前未出现喘息史、过敏史、湿疹史等；
②三代以内直接家属中无哮喘、鼻炎等疾病；
③近期未服用免疫调节剂、激素、抗生素等药物。
1.1.3 两组基本资料 以上两组儿童祖孙三代及以上均为壮族，个体之间没有血缘亲属关系，年龄、性别差异无统计学意义(t=0.574，χ2=1.818，P>0.05)。本研究已获得本院伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》道德原则，所有患儿和(或)家属均已签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器及试剂 DNA提取试剂盒(GK1043型)、PCR仪-A300(杭州朗基科学仪器有限公司)、3730XL基因测序仪(美国ABI公司)、电泳仪君意JY300C(山东博科科学仪器有限公司)、PCR MIX试剂(上海翊圣生物科技有限公司)、引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)、Taq DNA ligase(美国NEB公司)。
1.2.2 DNA提取 空腹抽取患者外周血1 mL，放入EDTA抗凝管中，去除红细胞后，严格按照离心柱法提取DNA，放入-20 ℃冰箱中保存。用分光光度计检测提取的DNA含量，并通过0.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度、纯度。
1.2.3 单核苷酸多态性检测 位点选择：本研究所选位点均来源于dbSNP数据库，有稳定遗传特性，且被国内外报道与儿童哮喘疾病发生有关。引物设计：根据GenBank所提供序列，用Primer 5.0设计位点扩增引物，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。PCR扩增：总反应体系15 μL，包括模板DNA 1 μL(20～50 ng/μL)、上下游引物各0.3 μL、2×PCR Mix 7.5 μL、双蒸水5.9 μL。充分混匀后放入PCR扩增仪。反应过程：95 ℃预变性5 min；
94 ℃变性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s，共循环35次；
72 ℃修复延伸10 min。LDR连接反应：总反应体系10 μL，包括PCR产物3 μL、10×buffer 1 μL、Taq DNA连接酶(40 U/μL)0.125 μL、探针(10 μM)0.2微升/条；
双蒸水 2.875 μL。反应过程：94 ℃变性20 s、58 ℃退火90 s，共循环30次。取1 μL延伸产物加入9 μL高度去离子甲酰胺(HiDi)冰水浴后测序。Gene Marker软件分析结果。
表1 5位点引物设计序列
2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 ADRB2 rs104271
3、FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs18-05010位点均检测出AA、AG、GG基因型，FCER1B rs1441586检测出CC、CT、TT基因型。经Haploview 4.1软件计算，以上位点在哮喘组与健康组之间的实测频率与期望频率差异无统计学意义(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律(见表2)，证明所选位点有群体代表性，可进行遗传学研究。基因峰型见图1。
表2 所选位点Hardy-Weinberg平衡定律遗传检验
表2(续) 所选位点Hardy-Weinberg平衡定律遗传检验
图1 FCER1B基因 rs569108、rs1441586 位点峰形图
2.2 基因型及基因频率的比较 经检验ADRB2 rs1042713、IL-4R rs1801275位点的基因型与基因频率在哮喘组与健康组之间差异有统计学意义(P<0.05)，两位点基因型AA数量及等位基因A的频率高于对照组；
FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108、IL-4R rs1805010位点的基因型及等位基因频率在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3～表7。
2.3 广义多因子降维分析 采用GMDR对所选位点(ADRB2 rs1042713，FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108，IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010)进行降维分析结果显示：FCER1B rs1441586和IL-4R rs1801275组成模型有哮喘预测作用。其预测模型准确度为60.00%，灵敏度为72.00%，特异度为48.00%，OR(95%CI)=2.374(1.0358～5.444)，χ2=4.245，P=0.039。见表8。
表3 两组儿童ADRB2 rs1042713位点基因型及等位基因频率比较
表4 两组儿童IL-4R基因rs1801275位点基因型及等位基因频率比较
表5 两组儿童FCER1B基因rs1441586位点基因型及等位基因频率比较
表6 两组儿童FCER1B基因rs569108位点基因型及等位基因频率比较
表7 两组儿童IL-4R基因rs1805010位点基因型及等位基因频率比较
表8 GMDR方法分析多位点交互作用的模型
2.4 两两位点协同比较 按是否携带ADRB2 rs1042713纯合子AA和FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010纯合子GG进行两两亚组划分。结果显示哮喘组中儿童携带AA+非GG的数量高于非AA+非GG。健康组中儿童携带AA+非GG的数量低于非AA+非GG。计算发现，哮喘组与健康组儿童在ADRB2 rs1042713AA+非GG与ADRB2 rs1042713非AA+非GG中差异有统计学意义(P<0.05) ，见表9。当哮喘组和健康组儿童ADRB2 rs1042713基因座为非AA+GG与ADRB2 rs1042713非AA+非GG时，哮喘发生风险差异无统计学意义(P>0.05)，见表10。
表9 ADRB2 rs1042713 AA基因型与FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位点两两协同比较
表10 ADRB2 rs1042713 非AA基因型与FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位点两两协同比较
哮喘是以反复发作的呼吸道气流受限、慢性气道炎症、气道重塑为主要表现的特异质疾病。长期发作可导致下气道产生病理学变化。全球约有3.34亿人患有哮喘[5]，儿童哮喘发病率高于成人，且有逐年上升趋势。随着医学分子生物学的不断发展，人们对哮喘疾病的认识逐渐从环境方面向生物医学方面转变。基于人类基因组测序的不断完善，更多与哮喘有关的基因已被发现，单核苷酸多态性(SNP)与哮喘疾病的发生已成为研究哮喘发病机制的热点问题。
通过检测儿童单核苷酸的变异程度来预测哮喘发生风险，已成为儿童哮喘预防的新方向。2009年由9个位点组成的汉族儿童哮喘易感基因预测模型被提出[4]，优化后提出了4位点汉族儿童哮喘预测模型[6]。经验证，两个模型均有较好的哮喘风险预测效果，且适用于低龄喘息性患儿[7]、新疆汉族儿童[8]和浙江地区儿童。壮族是中国人口最多的少数民族[9]，哮喘易感基因预测模型的筛选、模型建立、模型优化对壮族儿童哮喘的早期预防、延缓进展、改善预后等方面有着积极意义。
β肾上腺素受体(ADRB2)属于G蛋白耦联受体，由5号染色体(q31-q32)段编码。与哮喘相关的rs1042713位点突变属于错义突变(A>G)，突变后甘氨酸变为精氨酸[10]，导致编码蛋白质的三级结构出现折叠角度的变化和新的α-螺旋结构。这可能会影响细胞表面受体对支气管扩张药物的治疗反应。研究发现，rs1042713位点突变后对支气管舒张试验、长效β受体激动剂的反应变差[11]。王冰洁等[12]研究结果表明基因型AA对哮喘的发生具有预测性。KARIMI L等[13]认为rs1042713位点突变与患儿哮喘加重有关，同时还增加经糖皮质激素和长效β受体激动剂常规治疗后哮喘加重的风险，基因型AA可能是重度哮喘的预测因子。叶冬梅等[14]发现突变后的患儿发生肺功能异常的风险增高。但突变体是否会影响肺功能还需进一步研究。
IgE高亲和力受体(FCER1)为多链免疫识别受体，由1条α链、1条β链和2条γ链组成。FCER1在抗原提呈部位形成局部放大作用，增强肥大细胞[1]、嗜碱性粒细胞释放炎症介质，可延长IgE的半衰期，上调IgE介导的炎症反应。FCER1B位于11号染色体q13段，又称跨膜结构域4亚家族A成员2(MS4A2)，编码IgE高亲和力受体的β链[15]。rs569108位点位于免疫受体酪氨酸激活序列附近，突变后(A>G)，导致β链末端的237位氨基酸极性发生变化。由酸性负电亲水的谷氨酸变为非极性疏水的甘氨酸，影响了受体与IgE的结合，促使哮喘的发生[16]。rs1441586位于靠近5′端的活化T细胞核因子的启动子区域内，基因T可显著提高转录效率，其多态性可直接调控基因的转录。研究发现，rs569108位点多态性与儿童哮喘发病、严重程度有关，携带等位基因G的哮喘发病率较野生纯合子AA升高约1.5倍，其等位基因G可能是加重小儿喘息性疾病的危险因素[17]。YANG H J等[18]进行Meta分析认为，rs1441586位点与亚洲人的哮喘发病存在关联，且发现突变(T>C)后rs1441586通过上调启动子活性，增加IgE高亲和力受体β链的表达。等位基因T可调控外周嗜碱性粒细胞，使其表达的IgE高亲和力受体数量和转录活性降低。所以等位基因T被认为是儿童哮喘的保护性因素。
白细胞介素4的受体(IL-4R)由16号染色体的p11.2-12.1段编码，是多链复合型受体。IL-4R分为IL-4RA、IL-2RG/CD132/IL-2γc链组成的Ⅰ型受体和IL-4RA、IL-13RA1组成的Ⅱ型受体[19]。Ⅰ型受体主要介导JAK1和JAK3信号通路，Ⅱ型主要介导JAK1和JAK2信号通路[20]。目前发现，IL-4R与儿童过敏性湿疹的发病相关[21]，且已有24个IL-4R多态性位点与哮喘相关。当鸟嘌呤替代了腺嘌呤(A>G)后，位于第五外显子rs1805010的异亮氨酸变为了缬氨酸，第12外显子rs1801275的谷氨酰胺变为了精氨酸。影响信号转导转录激活蛋白6(STAT6)与蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-1)结合导致IL-4R与IL-4结合能力增强，增高了哮喘发病的风险。苏保宁[22]研究发现，rs1801275位点多态性与儿童哮喘易感性相关。A-M H等[23]研究发现两位点基因座为AA或AG时，体内分泌型IL-4受体(sIL-4R)数目虽高于正常儿童，但哮喘发病程度较轻。郑莎莎等[24]发现贵阳地区儿童中rs1801275、rs1805010位点基因座是等位基因G时，哮喘的发病风险分别增加了4.1倍和1.9倍。
本研究选取汉族9位点预测模型中的5位点进行多态性验证。结果显示所选位点均符合Hardy-Weinberg遗传定律。ADRB2 rs1042713、FCER1B rs56-9108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位点检测出AA、AG、GG基因型，FCER1B rs1441586检测出CC、CT、TT基因型。这与汉族儿童9位点预测模型中的基因型一致。哮喘组中ADRB2 rs1042713、IL-4R rs1801275位点的基因型AA、等位基因A高于健康组。FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108、IL-4R rs1805010位点的基因型及等位基因频率在两组之间差异无统计学意义。这与汉族9位点预测模型研究结果不一致。广义多因子降维分析后发现，FCER1B rs1441586、IL-4R rs1801275组成模型可为临床预测哮喘的发病提供依据。IL-4R rs1801275为主效应的模型，其预测模型准确度为60.00%、灵敏度为72.00%、特异度为48.00%。表明FCER1B rs569108、FCER1B rs1441586、IL-4R rs1805010可能不是广西儿童哮喘预测模型的有效位点，但后续模型优化时仍需排除位点的交互作用。为提高模型筛选位点的准确性，进行了5位点两两协同比较。本研究发现，ADRB2 rs1042713位点AA基因型有较高的哮喘发病风险。当ADRB2 rs1042713位点AA基因型与FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位点非GG基因型分别组合时，哮喘发病风险比ADRB2非AA组合增高约2.3倍。ADRB2 rs1042-713位点非AA基因型与FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位点任何基因型组合，均不增加哮喘患病风险。其余位点间未发现存在协同作用。
随着汉族儿童哮喘易感基因预测模型的不断完善，旨希望通过对汉族哮喘模型的借鉴与优化，扩大其适用范围并建立壮族儿童哮喘易感基因模型。本研究结果与现有国内外研究的结果差异的可能原因：①不同地域、不同民族基因多态性的差异；
②所选基因与其他基因位点或信号转导通路存在相互作用，但尚未阐明；
③由于地理位置、海拔、温度等因素造成的基因多态性不同。本研究的不足与展望：①所选位点有限，并未完全阐明基因、位点间的相互作用，需要更大的样本量对已有结果进行论证；
②位点排除后，未引入其他易感位点进行优化，需要引入更多位点对模型进行优化；
③健康对照组患儿未能完全排除哮喘发病可能，易造成结果偏移；
④需要与患儿发病严重程度、肺功能、用药改善、预后等情况相结合，完善预测模型的相关指标。
ADRB2 rs1042713、IL-4R rs1801275位点可能与广西壮族儿童哮喘发病相关，FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108、IL-4R rs1805010位点可能不是广西壮族儿童哮喘发病的危险因素；
FCER1B rs1441586、IL-4R rs1801275组成模型可为临床儿童预测哮喘的发病提供依据，但模型仍需进一步完善。