吴水良, 林可竟, 张一帆, 詹梦琳, 胡方平, 蔡学清
(福建农林大学植物保护学院,福建 福州 350002)
仙草(Mesonachinensis)又名仙人草、凉粉草，为唇形科仙草属1年生草本植物，主产于我国的福建、广西、广东等省份。仙草含有黄酮类物质、维生素等活性成分，是一种重要的药食两用植物资源[1]。目前，有关仙草病害的报道较少，主要有茄雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的细菌性青枯病[2-3]、果胶杆菌(Pectobacteriumsp.)引起的茎褐腐病[3]、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的茎叶枯病[4]、根结线虫(Meloidogynesp.)引起的根结线虫病[3,5]、菟丝子(Cuscutasp.)引起的草害等，以及由有害化学物质污染、水分失调、营养失调(缺锌、缺钾、缺氮)等引起的非侵染性病害[3]。随着人工栽培面积的不断扩大，危害仙草的病虫害种类及发生程度逐年加重，部分病害严重发生并造成减产，甚至绝收。
仙草在福建省栽培历史悠久，南平市建瓯区和龙岩市长汀县、武平县是福建省的主要种植地区。近年来，武平县种植的仙草发生了一种系统性病害。该病害危害仙草的根部和茎秆，初期叶片变黄、植株萎蔫，随后维管束褐变，最后植株死亡。该病害蔓延迅速，危害严重，轻则造成仙草减产，重则导致绝收，严重影响了该地区的仙草生产，给当地种植户带来重大的经济损失。通过切取病组织镜检，可见明显的溢菌现象，推测该病害由细菌引起。此外，田间症状与已报道的仙草细菌性青枯病(Ralstoniasolanacearum)相似[2]。鉴于在福建省尚未见系统鉴定该病害病原物的报道，本研究对其病原菌进行分离鉴定，以期为有效防治该病害提供参考。
1.1 供试材料
1.1.1 供试病株 2020—2021年采自福建省龙岩市武平县平川镇，于福建农林大学细菌学实验室进行病原菌的分离。
1.1.2 供试菌株 甘薯青枯菌菌株GSRS1、番茄青枯菌菌株FQRS1均由本课题组分离鉴定保存；
大肠杆菌JM109由本课题组保存。
1.1.3 供试培养基 NB、NA(NB培养基中加入20 g·L-1琼脂)以及TTC培养基的配方均参照方中达[6]的方法。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌分离纯化 参照方中达[6]方法对病组织病原菌进行分离，即用体积分数为75%的酒精溶液将病组织表面进行消毒后，用无菌水冲洗3遍，再用灭菌解剖刀切取约0.5 cm×0.5 cm病株茎部病健交界处的组织块，置于灭菌的培养皿内，加约0.5 mL无菌水破碎组织，静置30 min。后用接种环蘸取少量组织液在NA培养基平板上以分区划线法划线，置于28 ℃恒温培养箱(DZ47-63，宁波赛福)中培养，待其长出单菌落后用常规方法纯化，纯化后的菌株保存在-75 ℃低温冰箱(DW-86L386，海尔)中备用。
1.2.2 病原菌的致病性测定 将待测细菌接种到NB培养液，置于恒温摇床中，28 ℃、180 r·min-1振荡培养24 h，获得细菌悬浮液。将细菌悬浮液稀释为0.3×109CFU·mL-1后用于致病性测定。用伤根接种法和注射接种法测定病原菌的致病性。(1)伤根接种。用无菌小刀在仙草苗两侧切断根系，每株浇灌待测菌悬液30 mL，以无菌水接种作对照。接种后，观察发病情况并记录。(2)注射接种。用灭菌注射器吸取1 mL待测菌悬液注射仙草茎秆维管束，以无菌水接种作对照。接种后，保湿培养并观察记录发病情况。以上每处理重复3次。对上述接种后发病的仙草，进行病原菌再分离、纯化。
1.2.3 病原菌生物学特性和生理生化反应测定 采用负染法，在透射电子显微镜(JEM1010)下对细菌菌体和鞭毛的形态特征进行观察。参照方中达[6]的方法，将供试细菌在NA培养基平板上培养24～48 h，观察菌落颜色、大小、形状等性状特征。参照文献[7]的方法，测定供试菌株对木糖、海藻糖、丙三醇、葡萄糖、阿拉伯糖、肌醇和酒石酸钠等的利用；
以及菌株对果胶酶的活性、果聚糖利用、精氨酸水解、氧化酶实验、聚-β-羟基丁酸盐(PHB)的积累、KB产荧光现象、硝酸盐还原、41 ℃生长等生理生化反应。
1.2.4 马铃薯接种 用75%酒精溶液对马铃薯块茎表面进行消毒，在无菌条件下将其切成块状(3.0 cm×3.0 cm×2.0 cm)置于灭菌的培养皿中。用接种环挑取培养基平板上培养24 h的细菌菌落，涂抹到马铃薯小块上，并滴1～2滴(约10 μL)无菌水，同时在培养皿底部加入少许无菌水，30 ℃恒温培养箱中保湿培养24 h，观察马铃薯小块发病腐败情况。
1.2.5 青枯菌的特异性引物鉴定及其演化型和生化型测定 参照Opina et al[8]和Fegan et al[9]方法，利用青枯菌特异性引物759F/760R和演化型复合引物(Nmult21∶1F、Nmult21∶2F、Nmult23∶AF、Nmult22∶InF、Nmult22∶RR、759F、760R)进行PCR扩增，测定菌株的演化型。参照Huang et al[10]方法，测定菌株对3种双糖(麦芽糖、乳糖、纤维二糖)和3种己醇(甘露醇、甜醇、山梨醇)的利用。
1.2.6 16S rDNA基因扩增 利用通用引物27F/1492R扩增供试菌株的16S rDNA基因片段，其扩增体系和扩增条件同Lane[11]方法。扩增产物经电泳分析验证后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列输入NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，并利用BLAST软件比对分析，用 MEGA 7.0(Molecular evolutionary genetics analysis 7.0)软件进行系统发育分析，采用邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建发育树。
2.1 病害的症状
根部和茎秆是病害的主要危害部位(图1)。发病初期，顶部叶片表现中午失水萎蔫状，早晚恢复，随着病情的发展，病叶向下扩展至整株失水萎蔫，但植株叶片仍保留绿色，呈青枯状。4～5 d后植株萎蔫不可恢复，叶片发病部位沿着主叶脉向侧脉发生褐变，最后叶片变黄脱落；
根和茎基部维管束变褐，发病后期植株死亡。纵切茎秆，用手挤压，可见乳白色菌脓溢出。
A.田间症状；
B.病株；
C.病枝干。
2.2 病原菌的分离和致病性测定
从田间采集的病株上分离纯化获得了8株细菌菌株，编号为X1～X8。纯化后的菌株用于致病性测定和病原菌的鉴定。注射或伤根接种的致病性测定结果均显示，8株细菌菌株接种仙草后均产生与田间病株相同的症状，即初期可见仙草植株叶片变黄，后植株萎蔫，早晚恢复，后期维管束变褐，植株死亡。从接种后发病的植株上重新分离获得与原始接种菌株菌落形态特征相同的细菌菌株，经柯赫氏法则证实这8株细菌均是该病害的病原菌。
2.3 病原菌的鉴定
2.3.1 形态特征 供试菌株在NA培养基平板上培养48 h后，其菌落呈白色、圆形，边缘不规则，表面湿润，流动性大；
在TTC培养基平板上培养48 h后，其菌落中间呈粉红色，边缘白色，表面湿润，流动性大；
革兰氏染色阴性(G-)；
透射电子显微镜下观察到,细菌的菌体呈短杆状，两端钝圆，极生鞭毛1～2根(图2)。
图2 X1菌株的鞭毛(12 000×)
2.3.2 碳水化合物的利用及生理生化特征 X1～X8菌株对碳水化合物的利用和分解及生理生化测定结果见表1。从表1可见，X1～X8菌株均可利用木糖、海藻糖、丙三醇、葡萄糖、阿拉伯糖，不能利用肌醇和酒石酸钠；
精氨酸水解酶阴性，不能使马铃薯薯块腐败，在41 ℃下不能生长，在KB培养基平板上培养不产生水溶性绿色荧光；
PHB积累、果聚糖、氧化酶、果胶酶和硝酸盐还原反应均为阳性，其中除了氧化酶活性的测定结果与对照菌株GSRS1和FQRS1不同外，其余的测定结果均与GSRS1和FQRS1相一致。
表1 仙草细菌性枯萎病病原菌的生理生化反应和碳水化合物利用1)
2.3.3 青枯菌的演化型及生化型 青枯菌特异性引物759F/760R 的PCR扩增电泳结果显示，X1～X8菌株扩增出280 bp的特异性片段，与对照菌株FQRS1的扩增结果一致(图3A)。因此，将X1～X8菌株鉴定为青枯菌(Ralstoniasolanacearum)。青枯菌复合引物PCR扩增电泳结果显示，扩增出的2条条带片段分别为280、144 bp(图3B)，参照Fegan et al[9]青枯菌演化型框架的划分标准，将X1～X8菌株鉴定为演化型I；
X1～X8菌株对3种双糖(乳糖、麦芽糖、纤维二糖)和3种己醇(甘露醇、山梨醇、甜醇)的利用结果与对照菌株FQRS1和GSRS1相一致(表2)，根据Hayward[12]提出的青枯菌生化型划分标准，将X1～X8菌株鉴定为生化型Ⅲ。
表2 供试菌株的生化型测定1)
M.DL2000；
泳道1～8分别为X1～X8菌株；
泳道9.FQRS1;泳道10.无菌水。
2.3.4 16S rDNA基因序列分析 用细菌的通用引物27F/1492R对代表菌株X3进行PCR扩增，获得约1 500 bp的目的条带。经回收，将该基因片段转入大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆子，酶切验证正确后委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得的序列总长为1 517 bp (GenBank Nos. GI387861248)。通过NCBI在线序列比对，数据库中共有百余条16S rDNA部分序列与供试菌株的16S rDNA序列同源性在95%～98%之间，其中Ralstoniapseudosolanacearum和Ralstoniasolanacearum菌株的16S rDNA基因序列与X3菌株的16S rDNA基因序列同源性为98%。从GenBank中下载已提交的部分Ralstoniapseudosolanacearum、Ralstoniasolanacearum、Ralstoniasyzygii、Ralstoniapickettii等10个近源种菌株的16S rDNA基因序列，用邻接法构建系统发育树进行比较。分析表明，X3菌株与已登录的Ralstoniapseudosolanacearum菌株CIP 365、Ralstoniapseudosolanacearum菌株GMI 1000和Ralstoniapseudosolanacearum菌株MAFF 211475聚在一个分支上，它们之间的遗传距离最短，将X3菌株鉴定为Ralstoniapseudosolanacearum，演化型Ⅰ(PhylotypeⅠ)(图4)。
图4 X3菌株与相近种的16S rDNA系统发育树
根据Safni et al[13]2014 年对青枯菌重新划分的分类法，将新发生的仙草细菌性病害病原菌鉴定为假茄科雷尔氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum,异名：Ralstoniasolanacearum)，生化型Ⅲ。这与Liu et al[2]报道引起广东省仙草细菌性青枯病的病原菌(Ralstoniasolanacearum)相同。Fegan et al[9]提出了以演化型分类框架来描述青枯菌种以下的差异，演化型为亚种水平，并将已报道的青枯菌划分为4个演化型即演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，而演化型Ⅰ包含了所有来自亚洲的生化型Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。根据此演化型分类依据，已有研究报道侵染花生[14]、笋瓜[15]、番茄[16]、烟草[17-18]、胡椒[19]、桑[20]、姜[21]、星油藤[22]、蔷薇[23]等作物的青枯病菌(Ralstoniapseudosolanacearum)主要以演化型Ⅰ为主。依据Fegan et al[9]对青枯菌的分类框架鉴定表明，武平县发生的仙草细菌性枯萎病病原菌属于演化型Ⅰ(PhylotypeⅠ)，与已报道的相一致[14-23]。
目前，根据青枯病菌对3种双糖和3种己醇氧化产酸能力的差异，将生化型划分为5个，即生化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ[12,24]。She et al[15]报道，广东省16种寄主植物上分离的110株青枯菌菌株分属于4种生化型，即生化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，而生化型Ⅲ和Ⅳ为优势群体。姜青枯病菌[21]、星油藤青枯菌[22]和玫瑰青枯病菌[25]也属于生化型Ⅲ。林维英等[26]报道，福建番茄青枯雷尔氏菌有2个生化型，分别为生化型Ⅲ和Ⅳ，生化型Ⅲ占绝大多数。陈晓敏等[27]报道，福建花生青枯病菌属于生化型Ⅲ。本研究从福建仙草病茎上分离的菌株属于生化型Ⅲ，与已有报道的我国作物青枯菌的优势群体为生化型Ⅲ的结果相一致[15,20-22,24-27]。关于福建省仙草细菌性枯萎病菌是否存在其他的生化型，如生化型Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ，需收集福建省不同地区发生的仙草细菌性枯萎病菌菌株进一步测定。
猜你喜欢仙草青枯病生化烟稻轮作对烟草根际土壤微生物区系及青枯病发生的影响云南农业科技(2021年6期)2021-12-30从废纸篓里生化出的一节美术课少儿美术(2019年1期)2019-12-14仙草石斛的护肤传奇中国化妆品(2018年8期)2018-12-06保卫仙草大作战红领巾·探索(2018年10期)2018-11-14谁是半生化人小哥白尼(趣味科学)(2018年6期)2018-09-14《生化结合治理白蚁》中学生数理化·高一版(2018年6期)2018-07-09力量训练的生化评定中国体育教练员(2017年3期)2018-01-19麻辣鲜香“海底捞”②棋艺(2014年4期)2014-09-17麻辣鲜香“海底捞”棋艺(2014年3期)2014-05-29三种堆肥对番茄生长及青枯病防治效果的影响植物营养与肥料学报(2012年5期)2012-10-26