王益娜，陈碧环，郭兆宽，刘祥宇，张广辉，杨生超
(云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)
1996 年，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S288C 菌株)的基因组成为第1 个完全测序的真核基因组，对基因组组织和进化等具有重要意义[1]。作为一种广为人知的传统模式酵母，酿酒酵母具有产物安全性、丰富的基因编辑工具且容易操作，在工业中得到了广泛应用；
与细菌、其他酵母和丝状真菌相比，酿酒酵母对宽pH 范围、高浓度乙醇、糖以及高渗透压的耐受性使其成为与工业乙醇相关产品生产的首选宿主[2-4]。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种二态、非致病的非常规产油酵母[5]，因其高分泌能力、强大的乙酰辅酶A 和丙二酰辅酶A 通量[6-8]、大量的遗传工具[9-10]以及安全性[11]而受到全世界的关注。解脂耶氏酵母能在正构烷烃上生长并产生高水平的有机酸(如柠檬酸)以及大量异源蛋白质和代谢物[12-13]，被广泛用于重组蛋白、赤藓糖醇、柠檬酸和脂类等工业生产[14-15]。该酵母只能使用有限范围的C6 糖(如葡萄糖、果糖和甘露糖)[16]，但它可以利用醋酸酯、醇和疏水底物(包括油、烷烃和脂肪酸)；
作为专性需氧菌，该酵母对氧气浓度非常敏感，是影响其生命周期生长和代谢的重要因素；
其适宜的生长温度应低于32～34 ℃[17]，与酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母是一种Crabtree阴性酵母，不会产生乙醇，适合高密度发酵[18]。
芳香族化合物及其衍生物广泛应用于食品、饮料、化妆品、聚合物、营养品和制药等行业，其主要来源是石油资源。石油资源的过度开发及消费导致三大能源日益枯竭，污染日益严重[19]。人们通过构建微生物细胞工厂作为石油资源的替代来源，利用大肠杆菌和酵母等模式生物，以廉价的碳源或前体为底物生产芳香族化合物及其衍生物[20]。对香豆酸、对羟基苯丙酸、阿魏酸、咖啡酸和肉桂酸是许多具有商业价值的化学品的前体，其生物合成途径是生产芳香族化合物的核心代谢途径之一，同时也是生物合成多种天然产物(如黄酮类和生物碱)的主要底物[21]。然而，关于工程菌对不同酚酸类小分子物质的耐受性研究仍不够全面，目前还没有文献报道酿酒酵母和解脂耶氏酵母对酚酸类小分子物质的耐受性。本研究系统比较了酿酒酵母和解脂耶氏酵母对对羟基苯丙酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的耐受性，以期为芳香族化合物及其衍生物的合成提供参考。
1.1 试验材料
供试菌株包括酿酒酵母W303 和解脂耶氏酵母W29，均由中国科学院天津生物工业研究所保存。
1.2 试验试剂与仪器
酵母提取物(OXOID 公司)，蛋白胨(OXOID公司)，对羟基苯丙酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸样品(纯度大于98%，上海源叶生物科技有限公司)，DMSO (北京索莱宝科技有限公司)；
实时微生物生长曲线分析仪[杰灵仪器制造(天津)有限公司]，高压蒸汽灭菌锅(YXQ602 型)，恒温培养摇床(北京亿诺生物科技有限公司)，电子天平(上海梅特勒-托利多公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 YPD 液体培养基的制备
称量葡萄糖20 g、蛋白胨20 g 和酵母提取物10 g，溶于水中并定容至1 L，115 ℃灭菌20 min后制得。
1.3.2 种子液制备
将-80 ℃保存的甘油菌划线于固体YPD 平板中活化菌种，从平板中挑1 个单克隆接种于含有3 mL YPD 液体培养基的15 mL 试管中，于30 ℃、220 r/min 摇菌48 h 得到种子液。
1.3.3 不同浓度酚酸样品的配制
对羟基苯丙酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸底物配制初始浓度为2 mol/L 的母液，分别溶于DMSO 溶液后再稀释为1 mol/L 以及500、400、300、200、100 和50 mmol/L 等不同浓度。
1.3.4 酿酒酵母和解脂耶氏酵母细胞生长曲线的测定
用移液枪取1.3.2 节制备的种子液20 μL，将其加入含有YPD 液体培养基480 μL 的48 孔板中，每个样品3 个生物学重复；
将孔板置于实时微生物生长曲线分析仪中，温度设置为30 ℃，每2 h 测定1 次OD600值，连续测定24 h。测定完成后记录数据，以时间为横坐标、OD600值为纵坐标绘制生长曲线图。
1.3.5 酿酒酵母和解脂耶氏酵母对不同酚酸耐受性的测定
在48 孔板中加入YPD 液体培养基477.5 μL，并分别接种酿酒酵母和解脂耶氏酵母种子液20 μL，再分别加入不同浓度的酚酸样品2.5 μL，使酚酸的终浓度为5.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.50 和0.25 mmol/L，每个样品3 个生物学重复。设置2 组空白对照组，一组加入DMSO 溶液2.5 μL，另一组加入无菌水2.5 μL。
2.1 酿酒酵母和解脂耶氏酵母的生长曲线
由图1 可知：解脂耶氏酵母培养6 h 后进入对数生长期，18 h 后趋于平稳；
酿酒酵母生长缓慢，在48 h 后才进入平稳期。此外，解脂耶氏酵母的细胞OD600值可达6，而酿酒酵母的最大OD600值仅为解脂耶氏酵母的一半。
图1 酿酒酵母和解脂耶氏酵母细胞的生长曲线Fig.1 Cell growth curve of Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica
2.2 酿酒酵母对不同酚酸的耐受性
由图2 可知：5.00 mmol/L 对羟基苯丙酸和咖啡酸处理的OD600值与对照相比无显著差异，表明酿酒酵母可以耐受该浓度的对羟基苯丙酸和咖啡酸；
5.00 mmol/L 对香豆酸可显著影响酿酒酵母生长，表明其对酿酒酵母有毒性；
随着阿魏酸浓度的增大，酿酒酵母的OD600值减小，0.25 mmol/L阿魏酸即可显著影响酿酒酵母生长，当阿魏酸浓度为5.00 mmol/L 时，最大OD600值为1.5，而对照的最大OD600值为5.0，表明酿酒酵母不能耐受浓度为5.00 mmol/L 的阿魏酸；
0.50 mmol/L 肉桂酸即可显著影响酿酒酵母生长，当肉桂酸浓度为5.00 mmol/L 时，酿酒酵母已经完全不能生长。结果表明酿酒酵母对不同酚酸的耐受性表现为对羟基苯丙酸=咖啡酸＞对香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸。
图2 酿酒酵母对不同酚酸的耐受性Fig.2 Tolerance of S.cerevisiae to different phenolic acids
2.3 解脂耶氏酵母对不同酚酸的耐受性
由图3 可知：5.00 mmol/L 对羟基苯丙酸和咖啡酸处理的OD600值与对照相比无显著差异，表明解脂耶氏酵母可以耐受该浓度的对羟基苯丙酸和咖啡酸；
5.00 mmol/L 对香豆酸对解脂耶氏生长有显著的影响，该浓度下最大OD600值为4，而对照的最大OD600值为6，表明5.00 mmol/L 对香豆酸的毒性较小；
5.00 mmol/L 的阿魏酸和肉桂酸均可显著影响解脂耶氏酵母生长，且该浓度下，阿魏酸和肉桂酸处理的最大OD600值均为2，而对照的OD600值均为6，表明解脂耶氏酵母不能耐受浓度为5.00 mmol/L 的阿魏酸和肉桂酸；
此外，0.25 mmol/L 肉桂酸、1.50 mmol/L 阿魏酸即可显著影响解脂耶氏酵母生长。结果表明解脂耶氏酵母对不同酚酸的耐受性表现为对羟基苯丙酸=咖啡酸＞对香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸。
图3 解脂耶氏酵母对不同酚酸的耐受性Fig.3 Tolerance of Y.lipolytica to different phenolic acids
总体来看，解脂耶氏酵母对不同酚酸的总体耐受性大于酿酒酵母。如：0.25 mmol/L 阿魏酸可显著影响酿酒酵母生长，而1.50 mmol/L 阿魏酸可显著影响解脂耶氏酵母生长；
2.50 mmol/L肉桂酸可完全抑制酿酒酵母生长，而解脂耶氏酵母在5.00 mmol/L 肉桂酸处理下仍可生长，可见，解脂耶氏酵母更适合生产肉桂酸衍生化合物。
目前，已有很多利用微生物进行天然产物异源生产的研究。常用的异源表达系统有大肠杆菌、酵母和枯草芽孢杆菌，但由于原核表达系统缺少翻译后加工过程，使得异源表达的酶活性受到一定的影响，因此，酵母作为真核生物得到了广泛的研究和应用[22-23]。国外已有研究通过一系列代谢工程策略从酿酒酵母中产生25 g/L 青蒿酸，这是合成生物学领域的开创性成果[24]；
国内研究人员也在人参皂苷异源生产中通过改造酵母菌株生产出5.74 g/L 人参皂苷CK[25]。但是，与萜烯类和生物碱类天然产物相比，黄酮类化合物的扩大培养效果不佳，在发酵罐中达不到理想的产量[26]。
前体小分子自身的毒性作用给黄酮类化合物的大量生产带来困难。本研究通过分析酚酸类小分子对酿酒酵母和解脂耶氏酵母的毒性发现：2 种酵母对不同酚酸的耐受性有差异，解脂耶氏酵母对酚酸的总体耐受性大于酿酒酵母，且更适合生产肉桂酸衍生化合物，但2 种酵母对不同酚酸的耐受性基本一致。本研究中，解脂耶氏酵母对对香豆酸的耐受性研究结果与PALMER 等[27]的研究报道一致。已有报道没有全面比较酿酒酵母和解脂耶氏酵母对不同酚酸的耐受性研究，本研究通过比较这2 种酵母对不同酚酸的耐受性，为宿主的选择提供了依据；
同时可以利用耐受性的差异特性，通过更换不同的底盘酵母达到较高的生产水平，从而进一步实现工业化生产。本研究可以为解析酚酸类小分子抑制机制提供参考，也可为进一步提高芳香氨基酸衍生物在酵母中的合成效率提供新思路。
酿酒酵母和解脂耶氏酵母对不同酚酸的耐受性趋势一致，均表现为对羟基苯丙酸=咖啡酸＞对香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸，且解脂耶氏酵母对酚酸的耐受性大于酿酒酵母。解脂耶氏酵母更适合用于生产芳香氨基酸衍生物，尤其是肉桂酸类衍生物的生物合成。
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