陈 帅，任 林，周镇乔，李 敏，贾宏博
（1. 广西大学 物理科学与工程技术学院和脑与智能研究中心, 广西 南宁 530004；
2. 中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所, 江苏 苏州 215163）
1930年，物理学家Maria Goeppert-Mayer在其博士论文《研究原子的双光子吸收之可能性》中指出双光子的吸收是介质吸收两个光子的过程，该过程中单个光子能量无法使介质中的分子从其基态变成激发态，只能使两个光子在极短的时间内（ps量级）同时被吸收，从基态通过一个虚态最后达到激发态，过程中将有两个光子被吸收，所以称为双光子吸收。基于该理论，1990年，博士生Winfried Denk提出了一种成像技术：双光子激光扫描显微镜，该技术的出现对神经科学研究产生了革命性影响[1]。相比于单光子荧光激发，双光子荧光激发需要更长波长和更高光子密度的激光。这些红外激发光在生物组织中散射小，且只有焦点附近小体积的荧光分子能被激发，因此提高了成像深度和信噪比，并使得双光子在厚生物组织中仍能具有极高的三维空间分辨率(～0.5 μm)，结合双光子光毒性小等优点，双光子显微镜非常适合用来对脑神经细胞活动进行在体成像[2-4]。
自1997年，Winfried Denk等人首次将双光子显微成像技术用于在体观测小鼠大脑的锥体神经元的感官刺激修道树突钙离子动态以来，双光子显微镜在神经科学研究领域的潜能完全凸显[5-6]。但是初代双光子显微镜存在成像视野小、成像通量低、镜体体积较大的问题，限制了其获取生物图像信息的能力。尤其是其主要适用应用场景暨脑科学在体神经细胞形态和功能研究，特别需要跨尺度成像技术的发展。因为神经细胞具有与身体其他器官细胞完全不同的形态和功能。神经细胞互相连接组成全脑范围的复杂网络，一个皮层单个神经元的轴突投射范围就几乎可以从大脑皮层的一侧半球直接到达另一侧半球，大脑神经活动信息传递的距离（小鼠：cm量级；
人类：dm量级），相比于释放神经递质的突触尺寸（μm量级），其尺度至少跨越4～5个数量级，因此对于空间跨尺度成像有很高需求[7-8]。在深度维度上面，双光子显微镜激发光的波段集中在600～1 100 nm，该波段的光子最容易被水吸收而不易被组织中的其他物质吸收，因此有较强的穿透能力，双光子显微镜的探测深度可达700～1 000 μm，而小鼠脑皮层的厚度约为1 mm，因此双光子显微技术刚好可以观测小鼠脑皮层各层的神经元及其信号。而小鼠脑皮层以下的区域如下丘脑、海马等，其深度在皮层下大于1 mm处，因此深层脑区域成像也对双光子显微镜在扩展成像深度的尺度上提出了新需求[9-10]。在时间维度上，神经突触间的信号传递时间在10 ms量级，为了能更高效地探测到神经元信号，需要更快的扫描速度对信号进行捕获。目前基于共振镜扫描的双光子图像刷新频率为10～30 Hz，在该频率下通常只能满足记录反映神经功能活动的钙火花信号（～100 ms量级）的需求，目前最新发展的反映膜电位活动和谷氨酸等化学信号的新型荧光探针，响应速度更快，记录的信号能更直接真实地反映神经动作电位的活动情况，但是要求双光子显微镜的扫描成像速率达到100～1 000 Hz量级，即在时间尺度上需要提高1～2个数据级[11-13]。双光子显微镜实现了实验动物处在活体状态下的脑神经结构与功能成像，但是需要对实验动物的头部（通常是颅骨）进行固定，并放于显微镜镜头下进行成像，动物的行为依然受限且经常需要全程麻醉处理。当前脑功能研究通常需要结合动物行为学实验，许多行为学实验设计要求实验动物能在m级范围内自由清醒活动，而传统的固定台式显微镜几乎不可能做到在这样大的范围中仍保持μm级显微分辨率，因此最近头戴式双光子成像探头也是一个重要的发展方向，其需要双光子显微镜在自身体积尺度下进行减缩，同时增加实验动物在成像过程中可自由活动的尺度范围。
本综述将在介绍双光子显微镜工作原理的基础上，详细介绍近年来双光子显微镜在成像视野、成像通量、成像深度、分辨率等方面取得的跨量级技术指标突破，并讨论跨尺度双光子在体显微成像技术发展的难点及未来挑战。
2.1 双光子荧光激发原理
荧光团分子中最外层的电子轨道决定了其作为荧光化合物的荧光量子产率以及吸收和发射光子的波长。当荧光化合物在其所谓的“基态”中吸收光能（光子）时，分子的电子态、振动态和旋转态就会发生改变。吸收的能量有时会将电子移动到离原子核更远的轨道，其与原子核间的距离会随时间发生变化，最终这些被吸收的能量都会被释放。而振动弛豫和荧光发射是荧光团回到其低能基态的主要方式[14]，如图1（a）（彩图见期刊电子版）所示。荧光成像技术以及共聚焦显微镜，都是从光和物质的相互作用中产生对比度，由于单光子荧光效应是线性的，因此信号强弱与入射光强度呈线性关系。而在双光子激发等非线性荧光效应中，荧光信号大小与入射光强度呈非线性关系,如双光子激发中荧光信号大小与入射光强度的平方有关，因此其对激光强度的敏感度更高。激光强度在时空分布上未达到基态电子跃迁所需条件时，电子跃迁的概率极低。为了产生足够的信号，激发光必须空间和时间上高度集中[15-16]。高空间密度是通过高数值孔径(NA)物镜聚焦激光束产生的。时间上的高集中则需要使用激光器，发射“超短”脉冲（不到 1 ps）和相应的高峰值强度。对于宽度为τ、 频率为fR的激光脉冲，与连续波照明相比，非线性效应产生的荧光信号增强了1 /(τfR)n-1倍 ，n为激发过程中参与的激发光子总数，对于双光子荧光效应，n=2。由此可知，激发光子在时间上越集中，荧光信号越强[17]。以上两点使得基态的电子短期内（ps范围内）吸收多个光子后拥有足够的能量可以跃迁到更高能级上去，如图1（b）（彩图见期刊电子版）所示。
图1 （a）单光子和（b）双光子荧光激发原理Fig. 1 Excitation principles of (a) single photon and (b) two-photon fluorescence
相比于线性荧光显微镜，双光子荧光显微镜的优势主要有以下两点：（1）激发光的波长范围为670～1 070 nm，属于近红外光。由于在大多数组织中缺乏显著近红外光的内源性（单光子）吸收剂，因此，近红外光对生物组织的穿透性更强，其光毒性更小。而对于产生荧光而言，其主要分布在可见光波段，易于探测[18]。（2）当激光束通过显微镜物镜聚焦时，多光子吸收在空间上局限于焦点区域，非焦点区域被激发的可能性极低，因此，产生的荧光信号只会出现在目标区域，大大增加了信号的信噪比，减少了光损伤，增加了组织活力，便于对组织进行长期探测[19]。线性激发时在激光束会聚的整个过程里都容易激发出荧光，焦外荧光干扰严重；
非线性激发情况只有在焦点附近才发出荧光，因此非线性显微镜具有更高的空间分辨率和信噪比。
2.2 双光子激光扫描显微镜
双光子显微镜结构如图2所示，双光子显微镜的结构与共聚焦显微镜类似，但相比于共聚焦显微镜，双光子显微镜与其主要区别在于激发光源和荧光检测路径。双光子显微镜主要包括6部分；
飞秒激光器、光强调制器、激光扫描器、显微物镜、光电探测器、中央控制器和上位机软件，扫描器目前主流部件为机械振镜和声光偏转器[20]。双光子显微镜的激光器多为钛-蓝宝石振荡器，其重复频率(～100 MHz)与典型的荧光寿命相匹配，从而平衡了激发效率和饱和现象。该类激光器可以发射670～1 070 nm范围的激光，因此可以激活多种生物荧光物质[16]。激光的脉冲展宽需根据需求进行设置，通常为100 fs。小于该脉宽的脉冲相对更容易被光路上的色散光学玻璃加宽。而大于该脉宽的激光脉冲激发效率低，需要传递的能量更大，容易对样品造成热损伤[21-22]。共聚焦荧光显微镜在收集荧光的时候需要在探测器前放置一个针孔光阑来减少焦外荧光对目标区域信号的串扰。而对于双光子显微镜，其荧光信号几乎只在焦点产生，焦外荧光很少，因此不需要额外的辅助器件(如共焦小孔)来限制焦外荧光，从而显著增强了荧光收集效率。
图2 双光子显微镜结构示意图Fig. 2 Schematic diagram of two-photon microscope structure
3.1 成像视野
双光子激光扫描显微镜已被广泛应用于在体研究哺乳动物大脑中亚细胞分辨率的神经网络结构，双光子显微镜结合基因可编码钙指示剂(GECIs)已经成为在散射脑组织中进行神经元功能成像的标准技术[1,17]。然而，此类研究的范围通常仅限于大脑的单个功能区域。而解剖和功能观察表明，复杂的大脑功能来自于高度平行的计算[23-24]，其中感觉信息和行为参数被映射到全脑神经元种群，其范围超出了传统显微镜的视场（＜1 mm2），因此近年来出现了多种大视场的双光子显微镜系统。
多区域实时双光子成像技术（Multiarea Twophoton Real-time in vivo Explorer，MATRIEX），在传统单光束扫描双光子显微镜的基础上将物镜替换为双层复合物镜结构，上层使用空气物镜（DO）实现大视野成像，下层采用微型物镜阵列（MOs）起到二次聚焦放大的作用，将分辨率提高到μm量级，而且同时实现了多个分离区域的同时成像（图3（a），彩图见期刊电子版）。如中国科学院苏州生物医学工程技术研究所贾宏博课题组，使用MATRIEX实现了轴向和横向超过1 mm的成像视场，并同时记录了小鼠的初级视觉皮层、初级运动皮层和海马 CA1 区单神经元活动的实时功能成像，探测区域横向跨度最大可达12 mm，轴向最大跨度超过1 mm[25]。其另外一个优点是仅对物镜部分进行了模块替换，而没有改变双光子显微镜的其他硬件模块和控制时序，容易实现快速推广应用。缺点是虽然区域可选范围直径达到12 mm，但只能成像若干离散区域，没有实现大视野连续覆盖成像。
Mark J Schnitzer研究组开发一种离散多区域成像方法，其将两个显微镜（独立的扫描采集系统）放置在同一动物的大脑上（图3（b），彩图见期刊电子版）。这种双轴显微镜，因为使用的是完全独立的两套扫描、激发和探测系统，因此其不同区域可以同时被记录，成像面积可提升为传统双光子显微镜成像面积的两倍[26-27]，并且两个成像区域可以间隔较大距离，实现两个不同脑功能区的同时成像。然而，用这种方法对两个以上的大脑区域成像会大幅增加装置的成本和复杂性。
实现连续覆盖大视野脑皮层成像，首先需要设计并制作大视野高分辨的介观物镜[28-29]。如Spencer L Smith设计了一款大视野介观物镜（图3（c），彩图见期刊电子版），在保持μm级分辨率的同时将成像视野增加到25 mm2[30]。同时为了提高成像通量，通过偏振光学器件(PBS)将入射激光分为两束光路，同时使其中一路光的光程增加了1.87 m，比另一束光延迟6.25 ns到达脑表面。通过控制机动转向镜（SM1、SM2）和XY扫描镜（XYscan lens）改变光束在鼠脑XY平面的位置，再通过控制液体变焦透镜（ETL）来改变激发光在鼠脑Z轴方向上的位置，被调控的激发光通过物镜聚焦在指定位置。因为两束激光到达脑表面的时间不一样（同一脉冲相差6.25 ns），因此每束激光产生的荧光可以利用时分多路复用技术，对不同区域的荧光信号分开记录，有效提升了信号采样率。
Karel Svoboda研究组设计了大口径大视野介观物镜，成像视野直径达到5 mm（图3（d），彩图见期刊电子版）。在扫描方案上，他们通过共振镜串联一组大孔径振镜（20 mm），该共振镜组由3个振镜组成，两个振镜负责X-Y面扫描，另一个振镜管控扫描区域的选择。通过振镜组扫描和切换成像区域，共振镜提供高速扫描，实现了在视野跨度为5 mm×5 mm×1 mm范围对4个任意0.6 mm×0.6 mm的区域同时成像[31]。
图3 大尺度成像视野双光子显微镜。（a）多区域实时双光子成像技术[25]；
（b）双扫描系统双光子显微镜[26]；
（c）双扫描区域同步成像双光子显微镜[28]；
（d）多区域随机扫描双光子显微镜[31]。Fig. 3 Two-photon microscope with large-scale imaging field of view. (a) Multi-area real-time two-photon imaging technology[25]; (b) dual scanning system two-photon microscope[26]; (c) two-photon microscope with dual scanning area simultaneous imaging[28]; (d) two-photon microscope with multi-region follow-on scanning[31]
基于介观物镜，可以实现连续覆盖（非离散）的大视野脑皮层双光子成像[32-33]。但是目前在全视野和细胞分辨率（通常～1 μm）下进行连续覆盖成像，时间分辨率仍然低于1 Hz。若降低空间采样率要求（如5 μm），时间分辨率能提高到2～3 Hz，勉强达到钙离子功能成像的需求。更常用的应用成像模式仍是选定2～4个脑区的离散子区域，在不牺牲空间采样率下实现10～20 Hz的时间分辨率。
3.2 成像通量
双光子显微镜的成像通量决定了获取脑神经结构与功能信息的效率。脑神经网络机理研究越来越需要对大规模的神经元群落同时获取实时的功能信息，或者需要精准捕捉单细胞高精度树突网络中的高速神经动作电位信号，因此对双光子显微镜成像通量的提高提出了迫切的需求。
成像通量可以定义为每秒获取图像像素的总数，即为图像像素数乘以成像帧率。如果是三维体成像，还要乘以同时成像的深度方向层数，用三者的乘积对双光子显微镜的成像通量进行评估。
双光子显微镜非线性激发特点导致其每个激光脉冲所激发的体积受限，进而导致其常规成像通量在百万量级[21,30-31]。即使是上述的大视场双光子显微镜系统，仍然受限于点扫描激发速度，虽然成像视野或可选范围极大，但在实时成像条件下也只能对若干少量局部区域进行扫描成像，像素通量也仅勉强达到千万量级。
提高双光子显微镜成像通量的一种传统方式是采用宽场照明结合时间聚焦（Temporal Focusing,TF）方法[34]，但这一定程度减弱了双光子点激发的高空间选择性，令图像分辨率和信噪比下降。下面将介绍几种最新双光子高通量成像方法，它们通过多焦点或线扫描的方法实现亿级的成像通量，对分辨率的影响小于宽场照明结合时间聚焦方法。
一个发展方向是提高双光子体成像的通量[35-37]。Alipasha Vaziri研究组开发的光珠显微镜[37]，是一种基于多焦点扫描和时分复用技术的显微镜，像素通量仅受荧光寿命的限制，其特点是轴向上产生的多个存在脉冲延时的焦点覆盖了500 μm的轴向范围，可实现高通量的体成像。该套仪器的原理是将激光重复频率大幅降低（4.7 MHz），这么做的目的是在一个脉冲周期内产生足够多个焦点间的脉冲延时，相邻脉冲延时（6 ns）大于荧光寿命（～3 ns），足够区分各焦点产生的荧光信号，降低信号串扰。使用多重轴向多路复用模块将输入的激光分成N份，产生脉冲延时的同时改变激光发散度，令各个焦点聚焦在不同深度，形成“光珠”柱，并通过调整分光比令每束激光能量不一，使焦点能量分布与成像深度呈指数关系，以抵消成像深度对荧光信号强度的衰减作用（图4（a），彩图见期刊电子版）。该技术可以在鼠脑中最多同时追踪100万个神经元，成像通量可达亿级（1.41×108），最大帧率为9.8 Hz。
图4 快速扫描双光子成像技术。（a）光珠双光子显微镜[37]；
（b）多焦点快速扫描双光子显微镜[38]；
（c）快速线扫描双光子显微镜[39]Fig. 4 Fast scanning two-photon imaging technology. (a) Light beads two-photon microscope[37]; (b) multi-focus fast scanning two-photon microscope[38]; (c) fast line scanning two-photon microscope[39]
另外一个发展方向是使双光子二维成像的帧率高于1 kHz[38-42]。Mark J. Schnitzer研究组设计的平面多焦点双光子显微镜，通过微透镜阵列（20×20阵列）产生400焦点，进行同时扫描（图4（b），彩图见期刊电子版），其通过将焦点阵列倾斜一个角度，结合一维振镜扫描，同时形成400行扫描线，并用sCMOS相机进行荧光探测。这个方法的成像通量可达两亿，最大帧率为1 kHz[38]。Karel Svoboda研究组利用线扫描加快扫描速度。该显微镜以4个不同的角度扫描二维样本平面上的焦线（图4（c），彩图见期刊电子版），视野内每个点在每次线扫描过程中均被探测到，每个点对应一个时间位点，但同一个时间位点包含线内多个空间点的荧光信息，在样品荧光点稀疏程度较低时，通过压缩感知算法可以实现荧光图像的重建而且真实性较高。该方法的优点是仅用4次行扫描就完成了二维图像扫描，图像帧率达到1 kHz，缺陷是当视野内的荧光物质密集程度较高时，重建图像的真实性将降低。该方法可以使成像通量达到十亿[39]。此外，通过自由空间角啁啾增强延迟器件（Free-space Angular-Chirp-Enhanced Delay，FACED）对小鼠视皮层进行快速成像，图像帧率最快可达3 kHz，成像通量可达6.25亿[40-41]。另一种基于扫描焦点的光谱时间编码是通过扫描源的主动调制来产生频谱编码的皮秒脉冲序列，然后通过衍射光栅以线扫描方式依次照射到图像平面上，形成焦点线性阵列，该方法成像通量可达0.88亿，最快扫描帧率可达2 kHz[42]。
3.3 成像深度
Mark J Schnitzer课题组开发出一种使用光学器件梯度折射透镜（Gradient-index (GRIN) lens）配合双光子扫描显微镜的装置。该装置理论上可以在任意深度对细胞进行成像[43]。梯度折射率材料之前常用在自聚焦光纤当中，对于实验中用的梯度折射率透镜，从截面看，材料折射率随着距圆心的距离增加而减少，其圆心位置的材料折射率最高。入射光在透镜切线方向的分量随着透镜折射率的减少逐渐减小，直到达到全反射边界条件后，光切线的方向将发生变化，光线第一次到达轴线时，光线与轴线的夹角等于光线刚入射进透镜时与轴线的夹角，同理，当光线第二次达到光轴时，此时光线的方向与入射时的方向相同，将其称为光线在透镜中的空间频率。由于透镜很细，可以认为满足傍轴条件，因此所有的光线都会以该空间频率在透镜中传播，在1/2周期整数倍时汇聚[44-45]。如图5（a）（彩图见期刊电子版）所示（参考Mark J Schnitzer课题组相关技术成果）[43]。该技术大量应用于小鼠脑深处神经信号的探测，Yeka Aponte课题组使用该技术对小鼠脑深5 mm处的外侧下丘脑神经元进行16天的荧光成像（图5（a））[44]。Jianan Y Qu课题组将该技术和自适应光学相结合，用于观测小鼠海马神经元可塑性[46]。
图5 超深度探测显微成像技术。（a）梯度折射率透镜双光子显微镜[44]；
（b）三光子小鼠神经元成像[49]；
（c）三光子小鼠脑血管成像[51]Fig. 5 Ultra depth detection microscopic imaging. (a) Gradient refractive index lens two-photon microscope[44]; (b) threephoton neuron imaging in mice[49]; (c) three-photon cerebral vascular imaging in mice[51]
双光子成像中，最大可实现的成像深度与散射平均自由程成正比，并与所用的激光功率、双光子的脉冲时间、频率的倒数以及收集效率的对数成正比[47]。目前在最理想情况下，双光子的探测深度也只能达到1 mm, 再往下焦斑逐渐恶化[48]。而三光子荧光显微镜在对小鼠神经元活体成像时，最深探测深度可以达到1.4 mm。三光子显微镜和双光子显微镜类似，都属于非线性光学，激发过程中，荧光分子吸收3个光子，经过两个虚拟态分子由基态升至激发态。入射光的波前随着组织深度的增加产生畸变，导致系统成像质量下降，可通过自适应光学对入射光进行波前补偿，使得系统在组织深处也可以得到良好的光学分辨率[49-50]。Robert Prevedel课题组利用三光子技术呈现了小鼠脑皮层下1.4 mm处的海马树突精细结构和单个神经元活动情况（图5（b），彩图见期刊电子版）[49]。Wang Ke课题组利用三光子技术，将1 700 nm波长的光作为激发光，获得小鼠皮层下2.1 mm处血管的结构图像[51]（图5（c），彩图见期刊电子版）。
3.4 成像分辨率
大部分荧光显微镜的光学分辨率都在μm量级，这对于观测人体细胞（10～20 μm）可以满足需求，但是对于亚细胞结构，如中心体、高尔基体、线粒体、细胞骨架，细胞间的信号传导等，还远远不够。为了满足生物医学研究与发展的需求，超分辨率光学显微镜应运而生。超分辨率光学显微镜主要分为3类：（1）单分子定位显微镜（Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM）；
（2）受激辐射耗尽荧光显微镜（Stimulated Emission Depletion, STED）；
（3）结构光照明显微镜（Structured Illumination Microscopy，SIM)[52-54]。目前未发现有关SMLM和双光子技术结合的研究报道，而STED和SIM已被证明能与双光子成像技术结合并提高其成像分辨率。
STED显微镜的原理，荧光分子在激光照射下将从基态变成激发态，经过振动弛豫，荧光分子跃迁至激发态的最低振动能级，在无干扰情况下，处于激发态最低能级的荧光分子将通过发射荧光的方式退激发至基态。但荧光分子处于激发态，外界又给予激光照射时，则处于激发态的荧光分子会产生与外界激光相同频率、偏振、相位的辐射[55]。因此可以将辐射光以光圈的形式对激发光光斑进行照射，通过控制光圈内环的大小调整荧光激发区域，该技术实现了5.8 nm的分辨率[56]。
STED技术可以配合双光子显微镜使用，在进行深度探测的同时也保证了极佳的分辨率[57-59]。对于大多数STED-双光子显微镜来说，将同时应用两束不同波长的光，光路设计需要考虑光束畸变的问题[59]。最近，Alberto Diaspro课题组开发了一种单一光源的STED-双光子显微镜。原理如图6（a）所示。其选用特殊染料使耗尽光和激发光为同一波段的光。该技术可以实现80 nm的分辨率，远优于普通双光子显微镜的分辨率（0.5～1 μm量级）[57-58]。
SIM成像技术是一种改变照明光空间结构的照明方式，其将样品中不可见的高频信息携带到显微镜的可见低通频带；
通过改变图案方向和相位，记录荧光结果并得到多个图像数据集，再对数据集进行空间域和频域的傅立叶变化，提取携带的高频信息并重建出超分辨率图像。该技术原理如图6（b）所示[54]。
SIM结合双光子技术，使用电光调制器改变入射结构光的相位和角度，利用双轴振镜对样品进行逐点扫描。Qionghai Dai课题组采用对每个像素点取3个入射方向的结构光对样品进行照射（相邻方向角度差值为120°），每个方向的结构光中又包含3个等间距的相位角（相邻相位角差值为120°），每个像素点需要拍摄9张图，该方法所得重建结果，横向分辨率可达141 nm[60]。还有一种方法使用声光调制器形成5个相位角（相邻相位角差值为72°），再通过衍射光栅产生结构光，结构光的入射方向保持固定。该装置主要对样品进行线扫描，对小鼠神经元成像结果如图6（b）所示，其横向分辨率可达208 nm[61]。该技术除了具有优异的成像分辨率外，相对于STED，其成像速度快，使用低强度光源就可以产生足够的荧光信号，减少了光漂白的可能性[60]。SIM也可配合自适应光学方法使用。该设备对果蝇大脑和斑马鱼胚胎探测的横向分辨率可达170 nm左右[62]。
图6 超分辨率双光子显微镜。（a）STEM成像原理和实验数据[58]；
（b）SIM结构光生成方法和结构光与均匀光照射探测精度对比[60]Fig. 6 Super-resolution two-photon microscope. (a) STEM imaging principles and experimental data[58]; (b) SIM structured light generation method and comparison of structured light and uniform light irradiation detection accuracy[60]
以上技术主要针对双光子荧光显微镜横向分辨率的提升，也有课题组通过液体透镜配合自适应光学以及使用空间调制器来改善双光子荧光显微镜的轴向分辨率，他们可以将轴向分辨率提升至普通双光子显微镜轴向分辨的3倍[63-64]。
3.5 设备微型化
使用双光子显微成像设备探测动物的神经生理活动状态时，通常需要对小鼠头部进行固定。但一些科学问题，例如对空间导航和记忆的研究，不应束缚实验动物行为，才能得到更切合实际生理条件的结果。为了使实验结果更接近自然行为状态，科学家们研制了头戴式微型双光子显微镜[65-68]。程和平团队研制的微型化双光子显微镜探头质量只有2～3 g，和实验小鼠头部固连在一起，可以长时间记录小鼠在剧烈运动下的神经元活动（图7）[65]。该设备通过光纤传导激发光和荧光，结合微型化振镜（MEMS），电润湿可调透镜以及微型物镜等器件将双光子成像设备进行了微型化改造。Emily A Gibson使用微型化头戴式双光子显微镜对小鼠脑血管进行连续17天的观测[66]。最近，诺贝尔奖获得者Edvard I Moser团队在此基础上改进了微型光学系统和微型变焦透镜，开发了不足3 g的微型化双光子MINI2P系统，可以对自由小鼠多平面实现1 000个神经元钙成像，成功揭示了不同脑区细胞的空间联系[68]。
图7 超分辨率双光子显微镜实验结果[65-66]Fig. 7 Experimental results of super-resolution two-photon microscope[65-66]
综上所述，近年来双光子显微镜在多个维度上均获得了快速的发展，表1是本文介绍的新型双光子在体显微成像技术的一个简单汇总。在成像视野方面，通过改善单光轴大视野介观物镜或多光轴二级成像物镜结构，双光子成像视野直径由～1 mm提升至～10 mm，实现了一个量级的提升；
成像通量方面通过多焦点或线焦斑扫描，实现了近两个量级的提升，达到数亿像素每秒，局部图像帧率提高到1～3 kHz；
通过三光子或自适应光学方法，成像深度提升程度超过100%，采用侵入式的梯度折射率透镜可以将成像深度提高数倍，但对脑组织有一定损伤；
通过结合STED技术，双光子成像极限分辨率达到了80 nm；
微型化双光子显微镜的重量仅数克，远小于常规双光子显微镜数十公斤的重量，能被小鼠头部携带并在数米范围自由活动并同时成像。显然，相比初代双光子显微镜，当前双光子在体显微成像技术已获得了跨尺度的发展。
表1 双光子显微镜在多个尺度方向的性能提升进展现状Tab. 1 Progress in performance improvement of two-photon microscopy in multiple scale directions
但是需要看到的共性问题是，上述多光子显微成像技术都是仅在1～2个维度实现了跨尺度跨量级的技术指标突破，这可能与技术的应用场景需求有关，通常是集中针对某一、两个关键点进行巧妙设计或参数平衡，但目前还未能在多个尺度同时实现跨量级提高。
譬如使用梯度折射率透镜虽然能提高成像深度，但一方面是有损植入，另一方面自身视野有限，采用多个分离元件组合的方式也难以实现成大视野面积连续覆盖的成像[25,44]。而三光子技术无需破损皮层就能对超过1 mm深度的区域进行成像，三光子激发对单脉冲能量的要求比双光子激发要高，往往采用低重复频率高脉冲能量的飞秒激光器。低重复频率通常会限制成像通量，不过与时分复用多焦点技术对重复频率的需求一致，两种技术有结合的可能性，但如果焦点数量很多，则分到每个焦点的单脉冲能量仍然有限，简单增加激光器功率又容易对生物组织产生较大的热损伤，因此需要合理选取焦点数量[48-51]。
在提高通量方面，线扫描结合压缩传感进行图像重建要求样品满足一定稀疏性，故对其应用场景有所限制[39]。采用多焦点同时扫描是目前最佳的方案，其在焦点荧光信号区分方面，一方面可以与时分复用技术结合，但提高倍数有限，最终受荧光探针探测寿命限制；
另一方面可以使用CMOS等面阵探测器，但随着成像深度的增加，散射程度提高，面阵探测器成像分辨率将急剧下降。前述提到的高通量双光子成像方法，在小视野范围内的生物应用中已经取得了不错的成果，典型应用场景是记录单神经元树突网络的动作电位活动图谱，结合目前最新发展电压敏感探针或谷氨酸荧光探针，能以1 kHz成像帧率捕捉细小的树突棘上快速的动作电位信号[38]。在大规模神经元群落成像方面，目前一些高通量体积成像方法，如“光珠”轴向多焦点、贝塞尔轴向焦深扩展等，已经与大视野介观物镜技术相结合，并取得了一定成果，但其在进行全视野体成像的时候，为了达到钙成像的速度门槛，还是通过降低横向空间采样率（5 μm）的方式进行扫描成像，采样率虽勉强达到细胞直径（～10 μm）的奈奎斯特采样要求，但其较粗的空间采样率使神经元结构和功能解析精度降低了不少[37]。
微型化双光子显微镜的重量和体积大幅减小，但由于使用了MEMS扫描镜、微型物镜等小型光学器件，元件口径限制了成像视野直径，目前局限在1 mm以内（通常仅数百微米），如需在多个脑区域同时成像，势必需要使实验动物头戴多个微型化双光子成像探头，这又会增加动物的负重，更适合应用于体型较大的动物。除了成像视野，应用这些微型光学器件进一步提高成像速度和通量也极为困难，结合微型电润湿可调透镜进行轴向扫描或体成像扩展是不错的选择[65-68]。
结合STED技术虽然可以大幅提高双光子成像分辨率，但大视野范围内保持耗尽圆环光斑与激发圆斑对齐比较困难，因此目前未见该超分辨方法与大视野介观双光子成像相结合的研究。双光子技术与SIM结合可以将分辨率提高近1倍，但SIM技术需要对多幅经调制的图像进行算法解调，重建所需的图像数量很大，进一步降低了双光子的成像速度[57-62]。
综上所述，跨尺度双光子在体显微成像技术仍有许多难点需要攻克，仍有待进一步发展。而脑神经网络研究对于跨尺度在体成像的需求在很长一段时间内仍将为双光子成像技术发展提供强大动力。当前很多基于单光子激发荧光的成像技术，如光场显微镜，得益于单光子高的荧光激发效率，在实现高通量大视野体积成像方面有很大优势，但组织散射背景干扰等因素仍是其难以克服的障碍，这限制了其对神经结构功能信息的解析精度[69-70]。而多光子成像技术在散射组织内具有高保真的成像能力，获得的神经结构功能信息更接近真实情况，成像深度更是有3倍以上的优势，但非线性激发的特性对其通量提高有所限制，也是妨碍其真正实现跨尺度成像的核心因素。
实现大脑在体大视野高分辨率高通量成像，获得大规模神经元网络的结构连接与功能活动图谱，是解决神经环路工作机理的重要一步，目前脑科学领域已达成共识，这离不开跨尺度双光子在体显微成像技术的下一步发展。笔者认为，实现该宏伟目标首先需要大视野高分辨介观物镜的发展，这是实现大视野高分辨脑皮层连续覆盖成像的核心器件，但分辨率与视野之间存在天然的制约关系，这对光学设计与制造技术是一个挑战，而且进一步扩展视野直径后还需要考虑适配动物脑轮廓形状，这需要打破传统的平场显微光学设计范式[32-33]。其次，可结合三光子技术和自适应光学方法扩展成像深度，但三光子激发需要高单脉冲能量，采用低重复频率高脉冲能量飞秒激光器往往会导致成像通量有所降低[49]。结合SIM或STED技术提高空间分辨率也会降低成像通量，一方面空间分辨率的提高需要更高的空间采样率，即更多的采样点数；
另一方面如结合SIM技术需要对多幅图像进行重建，这会降低有效帧率[59,61]。因此，需要研究提高成像通量的新技术，至少要实现10 Hz附近钙离子成像所需的帧率，在各方面指标同时提高的情况下，成像通量需要至少提升2～3个量级才能保证实时成像。相比线扫描，采用多焦点技术有利于保持层析效果、信息串扰更少，有利于保证神经结构功能信息的解析精度和保真度[37-38]。最近的研究中使用时分复用技术或其改进技术以降低焦点间的串扰，有效提高成像通量。但时分复用技术的采样通量受限于荧光探针的荧光寿命，一般为～3 ns，因此仅结合时分复用技术，成像通量的提升上限为2×108～3×108pixel/s，这依然不能满足cm级大视野和高分辨成像需求。如果需要采用轴向的多个焦点实现体积成像，如“光珠”技术，则对成像通量的需求更高[28,39]。多焦点技术，在结合时分复用技术的同时，可进一步考虑结合在空间上有多个阵元的阵列探测器，在空间上进一步对各焦点产生的荧光进行区分，在时空两维同时进行焦点区分。这样一方面可以进一步降低串扰，另一方面将使可容纳的焦点数量大幅提高，有望实现2～3个量级的提高。热效应也是需要考虑的因素，大规模飞秒焦点并行扫描会产生更多热效应。为了避免动物脑组织产生严重热损伤，一方面可结合外部主动散热技术，另一方面需要研制更高效的荧光探针，用更少的激光能量得到更多的荧光光子。具有更低荧光寿命以及更长发射光谱的荧光探针有利于通量和成像深度的提高。可以期待，这些方面都在跨尺度双光子在体显微成像技术的下一步发展中得到实现。
自双光子显微镜诞生以来，在体脑成像研究的需求促使双光子显微镜在成像视野、成像通量、成像深度、分辨率、微型化等多个维度上性能指标有所提升。本文在介绍双光子显微镜工作原理的基础上，对近年来双光子显微镜在这些方面的快速发展情况进行了详细综述。总的来说，目前双光子显微镜在各个维度上均分别有了跨量级的发展，但仍未实现多个维度同时跨量级突破。量变产生质变，相信在不久的将来，将出现真正意义的在体跨尺度双光子显微成像技术，并在突破解析大脑“黑盒子”内部工作原理的过程中起到关键作用。
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