张博文，白海沈，薛西峰
（西安绿天生物技术有限公司，陕西西安 710000）
敏感性皮肤概念最早是由化妆品行业提出的，是指皮肤在受到物理、化学等外在因素或精神等内在因素刺激下，面部皮肤出现灼热、瘙痒、紧绷感等症状，并呈现出红斑、毛细血管扩张等特征。根据2017年《中国皮肤性病学杂志》所公布的数据，欧洲敏感性皮肤人群占25.4%～89.9%，美洲占22.3%～50.9%，我国女性的敏感性皮肤人群大约占36.1%[1]。由此可见，敏感性皮肤在世界各国都屡见不鲜。
卡瓦提取物是胡椒科植物卡瓦（Piper excelsum）的干燥根提取物，广泛分布于波利尼西亚、斐济、瓦努阿图等南太平洋岛国，其根与根茎皆可入药，有着放松肌体、抗真菌、镇痛、缓解紧张且毒副作用小等优点，其提取物具有显著的催眠、即时镇痛止痒、抗菌等多种类型的药理功效[2]。美业研究院统计，在2021年第二季度我国国家药品监督管理局的备案增长量排行榜中，卡瓦胡椒根提取物在舒敏领域排名第一，位居整个植物类提取物第二[3]。由此可见，卡瓦提取物备受化妆品行业的青睐。
斑马鱼（Danio rerio）是一种主要分布于巴基斯坦、缅甸、印度、孟加拉等地的热带淡水鱼，因其体积小、养殖方便、繁殖周期短等优点，被广泛用于科学研究中。除此之外，斑马鱼还具有与人类基因、皮肤结构以及免疫系统较高同源性与相似性的特点，因此是相关行业产品功效实验及评价的首选替代实验品[4]。本文通过卡瓦提取物DCR516在斑马鱼模型上进行初步的缓解刺激实验，进而探究DCR516对辣椒素受体，即TRPV1的舒缓功效，为护理行业能够更好地使用卡瓦提取物提供参考。
1.1 材料与试剂
甲基纤维素（货号M0512），德国Sigma公司；
二甲基亚砜（DMSO，货号D4540），德国Sigma公司；
冰乙酸（批号I1712010），阿拉丁试剂(上海)有限公司；
阿司匹林（批号J1910024），阿拉丁试剂（上海）有限公司，用100%的二甲亚砜（DMSO）制作成浓度为10 mg/mL的母液，于-20 ℃保存；
在实验开始前用养鱼专用水制作成1%的冰乙酸母液，按需稀释，现配现用。卡瓦“DCR516”，白色粉末，西安绿天生物技术有限公司出品，阴凉柜避光保存，用ddH2O配制成20 mg/mL母液，于-20 ℃冻存。KC2500（批号2211061），广东博溪生物科技有限公司；
PBS（0.01 mol/L），美国博士德公司；
TRPV1抗体，分析纯英国Abcam公司；
多聚甲醛，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SMZ645解剖显微镜，日本Nikon公司；
VertA1型CCD相机，上海土森视觉科技有限公司；
CP214型精密电子天平，美国Ohaus公司；
videotrack3.3行为分析仪，法国ViewPoint公司；
150i CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司；
SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
DM2500荧光显微镜，德国Leica公司。
1.3 实验动物
选取240尾经自然配对繁殖受精产出两天（2dpf）的AB型野生斑马鱼，每30尾为一个实验组，用于确定“DCR516”缓解刺激功效的最大检测浓度（MTC）；
选取180尾经自然配对繁殖受精产出两天（2dpf）的AB型野生斑马鱼，每30尾为一个实验组，用于“DCR516”缓解刺激功效的评价。将上述所有斑马鱼实验组饲养在温度为28 ℃的养鱼专用水中（水质：每1 L反渗透水中配备200 mg速溶海盐，电导率为450～550 μS/cm；
pH为6.8～7.5；
硬度为50～100 mg/L CaCO3），实验斑马鱼的使用许可证号为SYXK（浙）2012-0171，符合国际AAALAC认证的饲养管理要求。
1.4 实验方法
1.4.1 DCR516最大耐受浓度实验
在六孔板中放入随机筛选出的正常AB型野生斑马鱼（产出2 d），每孔放入30尾斑马鱼，容量为3 mL，分别在水中溶解“DCR516”制备成31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL、250.00 μg/mL、500.00 μg/mL、1 000.00 μg/mL 和 2 000.00 μg/mL实验组，不添加为对照组，共8组。各组分别处理24 h后，观察和记录每组斑马鱼的毒性表型和死亡数量，确定“DCR516”的最大耐受浓度（Maximum Talerated Concentration，MTC）。
1.4.2 DCR516缓解刺激功效评价
在六孔板中放入随机筛选出的正常AB型野生斑马鱼（产出2 d），每孔放入30尾斑马鱼作为实验组，其容量为3 mL，分别水溶给予222 μg/mL、667 μg/mL、2 000 μg/mL“DCR516”；
设置浓度为50 μg/mL的阿司匹林药品为阳性对照组，同时设置与其相对应的养鱼用水斑马鱼正常对照组以及模型对照组（在正常养鱼用水的基础上用冰乙酸建立疼痛模型），共6组。
各组分别处理24 h后，从每个斑马鱼组别中随机筛选出10尾斑马鱼放入96孔板中，每孔1尾，每孔100 μL。除正常对照组外，其余实验组均水溶给予0.009%冰乙酸建立斑马鱼疼痛模型，利用行为分析仪检测0.5 h内斑马鱼总运动距离（D，mm），以总运动距离评价“DCR516”对斑马鱼的缓解刺激功效。缓解刺激功效按式（1）计算。
判定标准：当缓解刺激功效＜20%或P＞0.05时，其缓解刺激效果不显著；
当功效≥20%且P＜0.05时，其缓解刺激效果显著。
1.4.3 DCR516对辣椒素受体的舒缓功效测试
1.4.3.1 测试目的及原理
敏感性皮肤是一种主要表现在面部皮肤的高反应状态。而TRPV1为门控离子通道受体，是一种广泛分布于神经系统中的多相受体，因与皮肤的灼热、疼痛都有密切关系，也称为辣椒素受体，是一种热敏感受体[4]。本测试的原理是基于TRPV1可以被各种配体直接或间接激活，从而使细胞内Ca2+含量升高，触发动作电位。本文测试的目的是通过辣椒素刺激角质形成细胞，激活TRPV1，进一步导致Ca2+内流，然后经过待测物作用后，通过检测TRPV1蛋白含量来评价待测物是否通过抑制TRPV1和Ca2+内流而达到舒缓的功效[5]。
1.4.3.2 测试过程
（1）细胞接种。将角质形成细胞按1.8×105个/孔的接种密度移到6孔板，并放入恒温37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育过夜。
（2）工作液配制。分别配制受试物工作液。
（3）给药。根据表1的测试方案，待6孔板中细胞铺板率接近40%～50%时，进行分组给药，每孔给药量为2 mL，每组设3个复孔，给药完成后将6孔板放置在同样条件的细胞培养箱中孵育培养24 h。
表1 实验设计方案
1.4.3.3 TRPV1检测
用4%的多聚甲醛对细胞进行固定处理，固定30 min后，进行辣椒素受体（即TRPV1）的免疫荧光检测，然后根据显微镜下采集到的数据，进行观察分析。
1.4.3.4 SAS数据处理
使用GraphPad Prism绘制作图，各试验分组之间的采用t-test进行统计比较分析，统计分析均为双尾，结果用Mean±SD表示，若P＜0.05，则认为具有显著差异，若P＜0.01则认为具有极显著差异[6]。
2.1 最大耐受浓度（MTC）实验结果
与对照组养鱼用水中的AB型斑马鱼相比，在给予浓 度 为 31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL、250.00 μg/mL、500.00 μg/mL、1 000.00 μg/mL 和2 000.00 μg/mL的“DCR516”时，各个实验组毒性表型未见明显异常，AB型斑马鱼死亡率为0%，最大耐受浓度为2 000.00 μg/mL。
2.2 缓解刺激功效
由表2和图1可知，模型对照组的斑马鱼运动总距离远大于正常对照组，说明模型建立可行。其中DCR516组的斑马鱼运动总距离在浓度为667 μg/mL时最短，同时其缓解刺激功效达到了33%，大于23%（最大检测浓度2 000μg/mL下的缓解刺激功效），表明卡瓦提取物DCR516对斑马鱼模型具有缓解刺激作用且功效显著。
表2 各实验组处理后斑马鱼总运动距离（n=10）
图1 “DCR516处理后斑马鱼行为轨迹图”
2.3 DCR516对辣椒素受体的舒缓功效分析
TRPV1检测结果及荧光图如表3、图2所示。
图2 TRPV1免疫荧光结果图
表3 TRPV1检测结果汇总表
与BC组相比，NC组的TRPV1蛋白含量显著上升，且其荧光图中NC组的荧光部分明显多于BC组，说明本次测试刺激条件有效；
与NC组相比，PC组的TRPV1蛋白含量显著下降，其荧光图中的荧光部分也与表中结果一致，说明本次阳性对照检测有效；
与NC组相比，样品DCR516在浓度为781 μg/mL时，TRPV1蛋白含量显著下降，蛋白表达量下调了28.3%，与荧光图中样品DCR516的荧光部分明显低于NC组得出的结果相一致。
根据卡尔提取物DCR516对斑马鱼模型的缓解刺激功效评价，证明了DCR516具有舒缓作用；
再基于皮肤角质形成细胞，通过对辣椒素受体TRPV1的舒缓功效测试，得出样品卡尔提取物DCR516确实能够通过抑制TRPV1蛋白的表达而达到舒缓的功效。