游 牧，王凯月，李强峰
(1.青海省林木种苗总站，青海 西宁 810000；
2.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)
柳属植物多为灌木，稀乔木，无顶芽，是北半球的主要木本树种之一，具有喜湿、耐寒、喜光亦耐旱等特点[1]。柳属植物往往分布于气候恶劣，土壤贫瘠的环境中，所以形成了易成活、抗性较强、生长迅速等特有的生理生态特性[2]。在我国柳属植物约有250种，主要分布于西北、西南和东北地区，青藏高原是现代柳属植物的重要分布中心之一。青海地处青藏高原东北部，是我国柳属植物较为丰富的地区之一[3]。
近年来全球气温不断升高[4]，而柳属植物大多喜湿冷，对高温的耐受力不强。高温条件不但影响柳属植物的生长表现，更是制约柳属植物资源引种的重要因子。而国内关于柳属植物的耐热性适应研究较少，因此研究青海地区柳属植物的耐热性，建立一套比较完备的耐热性评价指标体系是非常重要的基础工作。本研究以山生柳、乌柳、金丝柳、旱柳这4种青海地区常见的柳属植物为试验材料，测定其在高温胁迫下叶片的4个生理指标，比较4种柳属植物的耐热性，为青海高海拔地区柳属植物的引种栽培、园林绿化等提供理论参考。
1.1 试验材料
供试的4个柳属植物分别为山生柳、乌柳、金丝柳、旱柳，均来源于青海大通植物园。植物园位于西宁市宁张公路29km处，海拔2460m，年平均降水量532.6mm，年日照时数2275.5-2836.8h，年平均气温3.9℃，植物生长期为158d[5]。是一个集科研、生产、旅游为一体的综合园林基地。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计
取山生柳、乌柳、金丝柳、旱柳4个柳属植物1年生扦插苗的苗干截取插穗，于2020年4月上旬扦插在直径30cm、高30cm的塑料花盆中，每盆一株，盆中装入耕作土(田间持水量为30%)，期间在室温条件下进行常规的养护管理及病虫害防治，保证其正常生长。
在8月份将试验材料放入人工气候箱中进行热胁迫处理，设置20℃(CK)、30℃、40℃三个温度梯度，每个温度下恒温处理三天再依次升高到下一温度梯度，测定不同温度处理下4个柳属植物的叶片的SOD(超氧化物歧化酶)活性、脯氨酸(Pro)含量、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化氢(H2O2)含量四个生理生化指标，试验重复三次，采用隶属函数综合评价法对4个柳属植物进行耐热性综合评价。
1.2.2 测定指标
(1)SOD(超氧化物歧化酶)活性测定采用氮蓝四唑光化还原法[6]。
(2)Pro(脯氨酸)含量的测定采用酸性茹三酮法[7]。
(3)CAT(过氧化氢酶)活性测定采用紫外吸收法[8]。
(4)H2O2(过氧化氢)含量测定采用分光光度法[9]。
1.3 数据分析方法及数学模型
11个山生柳无性系的叶片指标数据采用模糊隶属函数法[10]进行综合评判，用隶属度公式对试验测定指标数据进行定量转换，再将各指标隶属函数值取平均值进行无性系间相互比较。使用Excel2010和SPSS23.0进行指标间的方差分析、相关性分析。
隶属函数公式为：
Xij=(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)
(1)
Xij=(xjmax-xij)/(xjmax-xjmin)
(2)
式中：Xij为i树种j指标的隶属函数值，Xij为i树种的j性状值，Xjmin为各树种j性状的最小值，Xjmax为各树种j性状的最大值。当j性状与植物的耐寒性成正相关时用(1)式，当j性状与植物的耐寒性成负相关时用(2)式。
2.1 四种柳属植物超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化
如图1所示，供试材料随着处理温度的逐渐升高，其SOD活性的变化趋势基本相似，均呈现随温度升高而逐渐升高的变化趋势。乌柳、山生柳、金丝柳SOD活性在高温胁迫过程中增加的较缓慢，而旱柳SOD活性在20℃(CK)-30℃升高明显。SOD活性在高温胁迫过程中的增加反映了四个树种随着温度的升高，超氧自由基不断增加，刺激了SOD活性的增强。由图1可以看出旱柳SOD活性水平偏高，由于SOD活性与抗逆性成正相关，说明其耐热性较强。
图1 高温处理下四种柳属植物超氧化物歧化酶活性变化折线图
2.2 四种柳属植物脯氨酸(Pro)含量的变化
大量文献研究表明，温度胁迫下耐热的植物体内积累的脯氨酸比不耐热的植物品种多，而且耐热性强的植物体内脯氨酸的含量维持积累时间长，维持积累量更大。植物体内脯氨酸可以调节渗透压并具有保护细胞膜结构稳定性的作用，与植物的抗逆性关系密切[11-12]。图2反映了相同温度处理不同树种叶片脯氨酸的含量变化，由图2可以看出，不同树种的叶片游离脯氨酸变化有两种类型，一种是先升高后降低，如旱柳，金丝柳，山生柳在20℃(CK)-30℃叶片脯氨酸累积增加，但30℃-40℃脯氨酸累积反而有下降的趋势，在30℃达到峰值，其中山生柳的增幅最大为9.87%，此结果表明当温度高于30℃时已不适合旱柳、金丝柳、山生柳的正常生长。另一种类型就是如乌柳在高温胁迫整个过程中脯氨酸含量均呈上升趋势，且在整个高温胁迫过程中乌柳叶片内游离脯氨酸的含量处于较高水平，表明其耐热性较强。
图2 高温处理下四种柳属植物脯氨酸含量变化折线图
2.3 四种柳属植物过氧化氢酶(CAT)活性的变化
CAT活性的大小与植物代谢强度以及抗性有着密切的关系[13]，如图3所示，供试材料随着处理温度的逐渐升高，其CAT活性的变化趋势基本分为两种，其中山生柳和金丝柳呈现逐渐升高的变化趋势，而乌柳、旱柳CAT活性在CK-30℃先下降，30℃-40℃再逐渐升高，在整个高温处理过程中，明显可以看出旱柳CAT活性一直处于较高水平，说明其抗热性较强，而山生柳的CAT活性较低，说明其耐热性较弱。
图3 高温处理下四种柳属植物过氧化氢酶活性变化折线图
2.4 四种柳属植物过氧化氢(H2O2)含量的变化
高温胁迫对四种植物叶片过氧化氢含量的影响如图4所示，四种植物过氧化氢含量均呈现先升高再缓慢降低的变化规律。在CK-30℃过氧化氢含量上升，升高的原因可能是在CK-30℃过程中过氧化氢酶(CAT)增加缓慢或出现降低；
30℃-40℃过氧化氢含量降低，降低的原因是由于高温胁迫下过氧化氢酶(CAT)活性的增加催化过氧化氢分解成氧和水。四种植物过氧化氢含量均在30℃时达到最大值，但增加幅度存在差异，其中山生柳相较于CK过氧化氢含量的增幅最大，增加幅度为138.97%，且在整个高温胁迫过程中其过氧化氢含量处于一个较高水平，由于过氧化氢含量与抗逆性呈负相关，所以证明山生柳的耐热性较差。在整个高温胁迫过程中，金丝柳、乌柳的过氧化氢含量处于较低水平，说明其抗热性较强。在温度恢复试验中，四种柳属经过高温胁迫处理后恢复至20℃，四种柳属植物过氧化氢含量均高于高温处理前水平。
图4 高温处理下四种柳属植物过氧化氢含量变化折线图
2.5 四种柳属植物耐热性的综合评价
由于不同植物的耐热机制不同，所以对耐热相关指标的响应也存在差异，单一指标并不能准确、真实地反映植物的耐热性强弱[14]，因此，采用隶属函数法得出各指标的隶属函数值及各材料的平均隶属度。4个柳属植物耐热性指标的隶属平均值越大则表明该树种耐热性越强，由此做出耐热性排序：旱柳>金丝柳>乌柳>山生柳。
表1 温度处理下山生柳4个柳属植物耐热性综合评价
2.6 相关性分析
运用SPSS23.0数据分析软件对SOD、CAT活性、过氧化氢含量、脯氨酸含量进行相关性分析。表2表明，过氧化氢含量与SOD活性显著相关，与脯氨酸含量呈极显著相关。
表2 四种柳属植物耐热性指标相关系数
植物耐热性往往是植物与环境相互作用的结果[15，16]，不同的植物其耐热机制也不尽相同，对某一特定耐热指标的响应也不尽相同，单一的指标难以准确地反映植物的耐热性强弱，多个指标的综合评价则较为全面准确[17]。SOD是植物体保护系统中重要的保护酶之一，在高温胁迫下，SOD可以通过激活植物体内的抗氧化系统，降低膜脂过氧化作用，启动植物的防御系统[18]。SOD的活性可以间接证明植物抗性的强弱，SOD活性的上升证明了高温胁迫下其清除自由基的能力增强[19]。本研究中，4个柳属植物均表现出升高的趋势，其中旱柳叶片SOD的活性较高，证明其耐热性较强；
在植物抗逆系统中脯氨酸是一种理想的有机溶质渗透调节物，在植物正常的生理活动中，脯氨酸的含量很低，但处于逆境时，就会增加脯氨酸的含量来维持植物细胞体内的正常代谢过程[20]，其积累指数反映了植物逆境条件下的渗透调节能力[21]。目前对植物体中脯氨酸的渗透调节作用研究最多，多数情况下认为，脯氨酸的含量与植物的耐热性强弱紧密相关，当植物处于高温胁迫时脯氨酸含量的上升速率与耐热性成正比。因此研究环境因子胁迫可以把脯氨酸的含量变化作为抗性生理指标[22，23]。在高温胁迫过程中旱柳，金丝柳，山生柳在20℃(CK)-30℃叶片脯氨酸累积增加，但30℃-40℃脯氨酸累积反而有下降的趋势，而乌柳叶片内游离脯氨酸的含量一直表现为升高趋势。这与马宁[24]对裸仁南瓜及张施君[25]对百合品种耐热性研究结果一致。而4个柳属植物在高温胁迫下叶片中CAT活性的变化存在较大差异，其变化趋势基本分为两种，其中山生柳和金丝柳呈现逐渐升高的变化趋势，而乌柳、旱柳过氧化氢酶活性在20-30℃先下降，30℃-40℃再逐渐升高，这也说明了无法用单一指标来评价植物耐热性的强弱，植物耐热性是一个复杂的综合性状。植物在受到高温胁迫时，细胞膜被破坏，膜透性增强，从而发生过氧化作用，导致叶片中的H2O2含量增加[26]，本研究中，四种植物在高温胁迫下叶片过氧化氢含量均呈现先升高再缓慢降低的变化规律。金丝柳、乌柳的过氧化氢含量处于较低水平，说明其抗热性较强。通过对4个柳属植物运用隶属函数法以及生理指标的相关性分析进行综合评价，结果表明：耐热性排序：旱柳>金丝柳>乌柳>山生柳。
本研究仅对4个柳属植物一年生苗木进行了高温胁迫下生理生化指标的测定，尚不能完全反映4个柳属植物的耐热性。但本文所测定的试验结果具有可对比性，可以体现出4个柳属植物耐热性的强弱，对今后青海高海拔地区柳属植物的引种栽培、园林绿化等提供理论参考。
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