南京地区无偿献血者戊型肝炎病毒筛查策略探讨*

时间:2023-08-22 08:30:02 来源:网友投稿

陈晓莉 冯雅颂 朱瑞 蒋昵真

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)为无包膜单链RNA病毒,属于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属,是全球范围内引起急性肝炎的最主要病原体之一。HEV感染普遍,且多为无症状感染,近年来日本和欧洲报道了很多HEV经输血及移植传播的病例[1-3],在输血行业引起越来越多的关注。目前,英国、荷兰和爱尔兰已经实施了普遍的HEV RNA筛查。德国和法国对用于高危患者的血浆进行HEV RNA筛查。西班牙的17个血库中已有2个实施了普遍HEV RNA筛查,日本对北海道地区实施HEV RNA筛查。但也有部分发达国家考虑到当地流行率不高,并未开展,如:美国、丹麦、瑞典及澳大利亚[4-6]。我国尚未制定有关HEV的筛查策略,但已经进行了许多前瞻性研究,可能受限于成本及操作方面的考虑,目前国内的研究大多是检测HEV IgM和IgG抗体[7-8]或在抗体阳性基础上进行HEV RNA或HEV Ag的检测[9]。但是有研究表明,血清学检测并不能为血液制品是否含有HEV RNA提供足够的证实证据[10-11],检测HEV RNA仍然是确认病毒血症的金标准[12]。同时,随着HEV Ag检测方法不断改良发展,其灵敏度和特异性大大提高,对于血液筛查和急性戊肝诊断有很好的应用价值。HEV RNA及HEV Ag可作为戊肝现症感染的指标,说明存在戊型肝炎病毒感染[13]。结合国外筛查策略,故本次研究联合使用HEV RNA及HEV Ag对2020年10月~2021年6月南京地区献血者进行普遍性筛查,评估南京地区献血者戊肝病毒的现症感染情况,并为是否需要将戊型肝炎纳入本地区的血液筛查项目及其筛查策略的选择提供数据支持。

1 标本 2020年10月~2021年6月无偿献血者标本26 048人份,这些标本均经过血清学常规筛查(HBV、HCV、HIV、TP及ALT),其中检测项目全部合格25 869人份,ALT不合格(>50 U/L)179人份。

2 仪器与试剂 STAR全自动加样系统(瑞士Hamilton公司),全自动酶免工作站FAME24/20(瑞士Hamilton公司),科华HEV核酸检测系统,AU480全自动生化仪,戊型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(上海科华生物工程股份有限公司),戊型肝炎病毒抗原检测试剂盒(ELISA)(北京万泰生物药业股份有限公司)(仅供研究使用),戊型肝炎病毒IgG抗体检测试剂盒(ELISA)(北京万泰生物药业股份有限公司),戊型肝炎病毒IgM抗体检测试剂盒(ELISA)(北京万泰生物药业股份有限公司),奥林巴斯ALT检测试剂盒,HEV RNA质控品(由国家卫生健康委临床检验中心提供)。

3 实验方法

3.1 HEV的筛查流程:检测流程见图一,凡HEV Ag反应或HEV RNA拆分反应者进行抗体补充实验并随访。HEV抗原及抗体检测均采用酶联免疫吸附法检测,操作严格按照说明书,检测OD值≥临界值(CUTOFF)者判为阳性。HEV RNA采用PCR-荧光探针法,测定结果CT值<40,表示该样本为HEV RNA反应性。

图1 戊型肝炎病毒筛查流程图

3.2 献血者随访:献血者首次被检出HEV RNA病毒及HEV Ag的时间被定义为第0天,间隔1~3月左右至少进行1次随访,随访至HEV IgM抗体转阴时结束。随访时采集标本分别进行HEV RNA单人份检测、HEV Ag以及HEV IgG/IgM抗体、ALT检测。随访时询问献血者有无从事农业养殖活动、有无生食饮食习惯,有无戊肝疫区接触史等情况。

3.3 HEV IgG抗体筛查:从26 048人份标本中随机抽取无偿献血者标本2 552人份同时进行HEV IgG抗体筛查。

1 戊肝筛查反应性检测结果 在26 048人份献血者标本中,共检出3例HEV RNA反应性,反应性率为0.12‰;
检出2例HEV Ag反应性,反应性率为0.08‰,此5例反应性献血者的ALT均小于50 U/L。对这5例HEV反应性献血者标本再补充HEV IgM和IgG 抗体检测,结果见表1。此外,26 048人份标本中含179例ALT均大于50 U/L(50.1 U/L~95.7 U/L),其HEV RNA及HEV Ag检测均无反应性。

表1 戊肝筛查反应性献血者信息及其检测结果

2 戊肝筛查反应性献血者的随访结果 5例中的D、E两位HEV Ag反应性献血者由于本人不愿意配合而失访,剩余3例HEV RNA反应性献血者A、B、C随访成功,随访结果见表2。值得注意的是,被随访的几名献血者无从事农业养殖活动、无生食饮食习惯,无戊肝疫区接触史,但均表示有外出烤肉店就餐史。

表2 HEV RNA反应性献血者随访检测结果

3 南京地区部分健康人群中HEV IgG抗体反应性率 2 552人份献血者标本进行HEV IgG抗体筛查,共检出530例反应性,反应性率达20.67%。

目前关于HEV感染的检测主要借助病原学及血清学检测,主要为HEV RNA、HEV Ag、HEV IgM及IgG抗体。戊型肝炎病毒的潜伏期约15~60天,感染后首先在血液和粪便中可以检测到HEV RNA及HEV Ag,随后出现HEV IgM抗体,持续时间相对较短,HEV IgG抗体出现在HEV IgM抗体之后。

HEV IgG抗体作为既往感染的指标,一般仅用于流行病学调查[14],其在体内存在时间较长,在感染戊肝恢复后10年仍然可以检测到[15]。在本次研究中,3例HEV RNA反应性献血者A、B、C(表2)在筛查出时均已存在HEV IgM和IgG抗体,随访可见HEV RNA最先转阴,其次是HEV IgM抗体分别在随访156天、62天、87天转阴,而未见HEV IgG抗体转阴,最长的第156天时仍存在HEV IgG抗体。根据2011年日本北海道[4]的数据报道,合格献血人群中HEV IgG抗体阳性率为3.4%,西班牙献血者的HEV IgG指标阳性率高达20%[6],对这类人群并未采取屏蔽。如果以IgG这一既往感染的指标屏蔽或延期这类献血者将会大大影响到血液供应。此外,也有不少研究提示HEV IgG抗体可能是一种保护性抗体:一项通过恒河猴的实验得出高浓度的IgG是预防HEV再感染的重要因素[16],在戊肝疫苗的一项研究中也发现74.41%的疫苗接种者可检测到HEV IgG抗体[17]。因此,不宜使用HEV IgG抗体作为戊肝输血风险的筛查指标。

HEV IgM抗体是HEV近期感染的标志物,从献血者的随访结果看,IgM抗体与HEV RNA在时间上存在交集,但是IgM抗体的转阴均晚于HEV RNA,即体内HEV RNA清除后IgM抗体仍然存在。有报道称,有的个体其IgM抗体在戊型肝炎恢复后存在5个月的拖尾期[13],甚至长达3年[18]。因此,如果用IgM抗体作为筛查项目,则可能会将一部分早期感染恢复者误判为现症感染者。其次,在免疫系统受到抑制和慢性HEV感染者中通常也检测不到HEV IgM抗体,这些都使得IgM指标诊断戊肝的特异度降低,很难作为血液机构筛查戊肝的可靠指标。再次,国际上有关戊肝抗体的商品化试剂,不同厂家的抗体阳性率差异可达10倍以上[19],且重复性差,抗体试剂盒检测的灵敏度和特异性有待进一步提升。这可能也是国外血液机构对HEV仅进行核酸检测而不进行抗体筛查的原因之一[5-6]。

HEV RNA检测对戊肝诊断具有高灵敏度和高特异性,尤其对于慢性戊肝患者以及免疫功能低下人群有着极大的优势,是戊肝诊断的“金标准”[13,20],本次筛查出3例HEV RNA反应性献血者,其中献血者B的混样检测CT值达到36.41,通过随访证明确为真阳性,可见HEV RNA检测对低病毒载量的标本仍能检出。HEV Ag是戊肝现症感染的另一个指标,存在于急性戊肝感染的早期阶段,在慢性戊肝感染中可能持续更长时间。目前,戊肝抗原诊断试剂经过不断优化,达到了95.24%的灵敏度及98.75%的特异性[21],尤其在急性肝炎、肝衰竭、免疫抑制及爆发人群中,表现明显优于商业化的HEV IgM抗体试剂。从本次研究的HEV RNA、HEV Ag的筛查结果看,两种筛查指标结果存在不一致,这两种方法不可互相替代。HEV RNA反应性献血者的HEV Ag呈非反应性,分析原因可能是抗原被中和导致,因为3位献血者体内均已存在HEV IgM和IgG两种抗体。2例HEV Ag反应性献血者的HEV RNA、HEV IgM、IgG抗体均呈非反应性,与厦门地区一项研究中4例HEV Ag反应性献血者,核酸及抗体均无反应性相一致[22],可能这类献血者处于感染早期,病毒载量较低,而且戊肝是RNA病毒,容易降解,因此抗原反应性者体内反而检测不到HEV RNA。当然,也不排除HEV Ag是假反应性的可能。遗憾的是2例HEV Ag阳性献血者因本人不愿意配合而失访,未能开展后续的验证实验。

既往有研究认为ALT检测可作为HEV感染的筛查指标[23],在本次研究的26 048名献血者中共有179例标本为单纯ALT不合格,均未发现HEV RNA、HEV Ag呈反应性;
而本次筛查出的HEV感染献血者的ALT均为正常。本次研究结果与日本SAKATA等人[24]的研究结果一致,说明ALT筛查对HEV感染的献血者可能是一个不敏感的筛查指标,不宜用于筛查。

对HEV RNA阳性献血者随访发现3例献血者在献血前均存在烤肉食用史,这种感染可能与摄入含病毒的未煮熟的食物有关。根据检出人群性别结果显示,男性与女性戊肝现症感染率之比为3∶2,男性感染概率更大,可能与社交活动、职业选择以及生活方式的差异有关。在本次研究中戊肝的现症感染者覆盖各年龄层,与文献中报道的中老年人戊肝发病率较高[25]不一致,可能是因为本文研究对象为献血人群,年龄限制在18周岁~55周岁,已经剔除了老年人这部分人群。南京献血人群戊肝感染者多为职员,与其他报道的感染人群多从事养殖、农业活动[25]有所差异,这种差异的主要来源为南京城镇化率较高,企事业单位和学生为献血主要人群。

中国医学科学院输血研究所系统分析了五个电子数据库22项独立研究的14篇文章,最终结果显示

中国献血者HEV IgG、HEV Ag、HEV RNA的阳性率分别为29.2%、0.1%、0.1%[26]。在本次研究中南京市献血者IgG抗体阳性率为20.67%,HEV Ag反应性率为0.08‰,HEV RNA反应性率为0.12‰,南京HEV Ag、HEV RNA的阳性率远远低于全国数据库的研究结果,反映南京地区戊肝病毒感染处于一个低水平状态,输血感染HEV的风险较低。当然,VOLLMER等人[27]发现,与核酸混检相比,核酸单检的检测率要高出约50%,本实验中核酸检测采用6混样模式,有存在漏检的可能性。本次研究未满一整年且HEV IgG抗体筛查仅随机抽取部分人群,导致本文在戊肝流行病学特征研究方面有所欠缺;
同时,随访策略需要进一步优化,有助于提高随访成功率。

综上所述,HEV RNA及HEV Ag联用可作为戊型肝炎的血液筛查指标;
南京地区作为戊型肝炎的低流行地区,尚无必要在现有血液筛查基础上增加HEV筛查。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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