王越欣，李媛媛，王 梅，张文智，冯 敏，冀来喜，倪 艳
（1.山西省中医药研究院，山西 太原 030012；
2.山西中医药大学，山西 晋中 030619）
艾椒散来源于治疗银屑病的临床经验方，已申请并授权发明专利（201610555543.9），由蜂房、苦参、川椒、土大黄、大枫子、芦荟、艾叶等7味药材组成，具有清热燥湿、杀虫止痒、活血化瘀之功效，疗效显著，价格低廉，且无副作用［1］。方中蜂房祛风止痛，杀虫止痒，祛腐生肌，消炎止痛［2］，为君药；
苦参、川椒、土大黄三药共为臣药，清热燥湿止痒，与君药配伍，能够加强祛风止痒之功效；
大枫子、芦荟二者共为佐药，既能加强祛风止痒之功，又能起到燥湿清热之效；
艾叶祛湿止痒，活血化瘀，散寒止痛［3］，作为使药，起调和诸药之用。目前尚无对艾椒散质量评价的相关研究，为了控制其质量，保证临床使用疗效，本研究参照处方的功能主治，对方中主要药味蜂房、艾叶和芦荟进行了定性鉴别，选择同时检测大黄素、大黄酚作为土大黄的质量控制方法［4］，为艾椒散制订了准确可靠的质量标准。本研究建立的方法具有较强的专属性和准确性，能有效控制艾椒散的质量，值得推广应用。
1.1 仪 器
Agilent 1100 series HPLC色谱仪（Agilent安捷伦化学工作站）、LC-300B型数控超声波清洗机（山东济宁鲁超超声设备有限公司）、DFY-200型200 g万能粉碎机（西安比朗生物科技有限公司）、RE5298A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、ZF1-Ⅰ多功能紫外分析仪（上海佳鹏科技有限公司）、YOKO-XR显色加热器（武汉科技新技术开发公司）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）、电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）。
1.2 药材与试剂
蜂房、苦参、川椒、土大黄、大枫子、芦荟、艾叶（生产企业均为安国市祁澳中药饮片有限公司）；
大黄酚（批号0796-200208）、大黄素（批号110756-201512）对照品均购自中国食品药品检定研究院；
甲醇为色谱纯，购自西陇科学股份有限公司；
聚酰胺（100-200目）、硅胶G，水为超纯水，其他所用试剂均为分析纯。
2.1 样品制备
按处方比例［1］称取药材后将其粉碎，70%乙醇浸泡过夜，用70%乙醇以合适的流速进行渗漉，收集渗漉液（终点为渗漉液变澄清）。将渗漉液减压浓缩后移入蒸发皿中，于水浴锅上蒸干并放入烘箱中烘干，将其研磨作为样品粉末。
2.2 蜂房的TLC定性鉴别
2.2.1 供试品溶液制备 取本品粉末1 g，加入70%乙醇15 mL，超声处理30 min，滤过，蒸干，加入1 mL甲醇溶解。将溶液加在聚酰胺柱（100～200目，1 g，内径为1 cm）上，用甲苯20 mL与70%乙醇10 mL依次洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用0.5 mL甲醇溶解，即得。
2.2.2 对照药材溶液制备 取蜂房对照药材1 g，按“2.2.1”项下方法操作，即得。
2.2.3 阴性对照溶液制备 按2.1项下方法制备蜂房阴性样品，取1 g，按“2.2.1”项下方法操作，即得。
2.2.4 鉴别 照薄层色谱（通则0502）试验［5］，分别吸取上述3种溶液10μL、15μL、10μL，点于同一硅胶G薄层板，以乙酸乙酯-甲醇-水（8∶1∶1）为展开剂，展开，取出晾干，喷以5%AlCl3乙醇溶液，置于氨蒸气中熏后，在紫外光365 nm下检视，供试品在与蜂房对照药材色谱相应位置上显相同的蓝色荧光斑点且阴性对照无干扰（见图1）。
图1 蜂房的TLC图
2.3 艾叶的TLC定性鉴别
2.3.1 供试品溶液制备取本品粉末2 g，加入石油醚（60～90℃）25 mL，置水浴上加热回流30min滤过，滤液挥干，残渣加正己烷1 mL使溶解即得。
2.3.2 对照药材溶液制备 取艾叶对照药材2 g，按“2.3.1”项 下方法操作，即得。
2.3.3 阴性对照溶液制备 按2.1项下方法制备艾叶阴性样品，取2 g，按“2.3.1”项下方法操作，即得。
2.3.4 鉴别 照薄层色谱（通则0502）试验［5］，分别吸取上述3种溶液10μL、5μL、10μL，点于同一硅胶G薄层板，以石油醚（60～90℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）为展开剂，展开，取出晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃下加热至斑点颜色清晰。艾叶的供试品色谱中，在与艾叶对照药材色谱相应位置上显相同的紫色斑点且阴性对照无干扰（见图2）。
图2 艾叶的TLC图
2.4 芦荟的TLC定性鉴别
2.4.1 供试品溶液制备 取本品粉末1 g，加入70%乙醇15 mL，超声30 min，过滤，蒸干，加1 mL甲醇溶解，即得。
2.4.2 对照药材溶液制备 取芦荟药材0.5 g，按“2.4.1”项下方法操作，即得。
2.4.3 阴性对照溶液制备 按2.1项下方法制备芦荟阴性样品，取1 g，按“2.4.1”项下方法操作，即得。
2.4.4 鉴别 照薄层色谱（通则0502）试验［5］，分别吸取上述3种溶液10μL、5μL、10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水为（8∶1∶1）为展开剂，展开，取出晾干，喷以5%AlCl3乙醇溶液，于紫外光（365nm）下检视。芦荟的供试品色谱中，在与芦荟对照药材色谱相应位置上显相同的黄色斑点且阴性对照无干扰（见图3）。
图3 艾叶的TLC图
2.5 土大黄HPLC含量测定
2.5.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Waters X-bridge C18（4.6×250 mm，5μm），流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25），检测波长：254 nm，柱温：25℃。理论塔板数按大黄素峰计算，应不低于4000。
2.5.2 对照品溶液的制备 取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制备成每1 mL中含有大黄酚37μg、大黄素38μg的溶液，摇匀，0.45μm微孔过滤，即得。
2.5.3 供试品溶液的制备 取艾椒散样品0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量。用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置于烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min。再加二氯甲烷10 mL，超声30 min，放冷，置于分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗涤容器，洗涤液并入分液漏斗中，分取二氯甲烷液。酸液再用二氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并二氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液经0.45μm微孔过滤，即得。
2.5.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.5.2”项下的对照品2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL、40μL注入高效液相色谱仪。以测得的峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。
表1 线性关系考察结果 （n=6）
2.5.5 精密度试验 精密吸取“2.5.3”项下艾椒散供试品溶液10μL，按“2.5.1”项下色谱条件连续进样6次，记录大黄素、大黄酚的峰面积，计算其RSD分别为1.6%、0.5%。表明仪器具有良好的精密度。
2.5.6 稳定性试验 精密吸取“2.5.3”项下艾椒散供试品溶液10μL，分别于样品制备后的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“2.5.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算大黄素、大黄酚含量的RSD分别为1.69%、0.47%。表明供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。
2.5.7 重复性试验 按“2.5.3”项下的方法制备6份艾椒散供试品溶液，精密吸取10μL，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定。结果测得6份供试品中大黄素、大黄酚含量的RSD分别为4.23%、3.52%。表明该方法具有良好的重复性。
2.5.8 加样回收率试验 精密称取艾椒散样品9份，每份0.4 g，分别准确加入大黄素对照品溶液（38μg/mL）11.00 mL、13.76 mL、16.51 mL，大黄酚对照品溶液（37μg/mL）15.77 mL、19.71 mL、23.65 mL，按“2.5.3”项下的方法制备加样回收供试品溶液，精密吸取10μl，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，计算各待测成分的加样回收率。结果见表2。
表2 加样回收率测试结果 （n=6）
2.5.9 样品测定 精密吸取3份供试品溶液各10μL，平行进样2针，两份对照品溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪测定，即得色谱图（见图4），结果显示，峰形理想，基线平稳，大黄素与大黄酚分离效果较好，且阴性对照无干扰。以外标法计算艾椒散中大黄素与大黄酚的含量。结果见表3。
图4 土大黄HPLC含量测定图
表3 样品含量测定结果
由表3可知，3份样品大黄素、大黄酚的平均含量分别为1.3075 mg/g、1.8225 mg/g。考虑到药材来源差异，本研究以略低于含量最低值设限，初步拟定艾椒散中大黄素的含量不得少于1.20 mg/g、大黄酚的含量不得少于1.80 mg/g。
蜂房的薄层鉴别照参考文献［2］实验中供试品和对照药材直接使用滤液，斑点不明显，且供试品图谱背景色较深，因此采用聚酰胺柱对其进行纯化。采用聚酰胺纯化供试品溶液时，考察了用甲苯、70%乙醇，水、70%乙醇依次洗脱，薄层鉴别结果显示采用甲苯、70%乙醇洗脱后斑点清晰而且分离效果较好，供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上显相同的蓝色荧光斑点且阴性对照无干扰，故采用此方法作为蜂房的薄层鉴别方法。
实验考察了芦荟样品的展开剂，分别比较了乙酸乙酯-甲醇-水两种不同配比的展开效果（100∶17∶13、8∶1∶1），结果发现以8∶1∶1比例展开，以5%AlCl3乙醇溶液为显色剂时，色谱图上斑点清晰而且分离效果较好，故采用此方法作为芦荟的薄层鉴别方法。
土大黄具有清热解毒、杀虫止血、祛瘀通便等功效［6］，其中大黄素和大黄酚为其中主要药效成分，大黄素具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗真菌、抗原虫等作用［7］，大黄酚具有抗菌等作用［8］。大黄素、大黄酚均以游离蒽醌和结合蒽醌的形式存在，本研究采用稀盐酸水解可将结合蒽醌全部水解成为游离蒽醌，便于含量测定。游离蒽醌溶于二氯甲烷等有机溶剂，不溶于水，在水解的同时加入二氯甲烷可使水解出的游离蒽醌溶于二氯甲烷，有利于萃取［9］。流动相比例的选择方面，实验前期考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸等不同流动相，结合峰形、基线和分离度等因素调整流动相比例，最终选定甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）作为流动相，峰形理想，基线平稳，大黄素与大黄酚分离效果较好，且阴性对照无干扰。
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