顾雄文 王彦 杨敏丽
摘要：石墨相氮化碳納米薄片（g-C3N4NSs ）是一种优良的电化学发光（ECL ）材料，在三乙胺（ Et3N ）为共反应剂时，阳极和阴极都能产生 ECL 信号，而多巴胺（DA ）对其阳极信号产生猝灭作用，但不影响阴极信号.利用这一特点，结合分子印迹聚合物（MIP ）技术，构建了一种检测 DA 的双电位比率MIP-ECL 传感器.首先将掺杂有多壁碳纳米管（MWCNTs ）的 g-C3N4NSs 固定在玻碳电极（GCE ）上，然后以 DA 作为模板分子，邻苯二胺（O-PD ）作为功能化单体，通过电化学聚合法引入 MIP 膜，洗脱模板分子后的传感器对 DA 具有特异性识别能力，利用 DA 对传感器阴阳极信号不同的影响作用，实现了对 DA 的高选择灵敏检测.传感器对 DA 的线性响应范围为1.0×10-10～3.0×10-7 mol ·L-1，检出限（LOD ）为0.063 nmol ·L-1（信噪比 S/N 为3），与非比率法相比，比率法的重现性得到了明显提高.
关键词：双电位比率法；
电化学发光（ECL ）；
石墨相氮化碳纳米薄片（g-C3N4NSs ）；
分子印迹聚合物（MIP ）；
多巴胺（DA ）
中图分类号：O 657.1 文献标志码：A 文章编号：1000-5137（2023）01-0030-08
A dual-potential ratiometric MIP-ECL sensor for detection of dopamine based on g-C3N4-Et3N system
GU Xiongwen1，WANG Yan2，YANG Minli1*
（1.College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；
2.Linzhou City Linqi Second Junior Middle School，Linzhou 456550，Henan，China）
Abstract：Graphite phase carbon nitride nanosheets（g-C3N4NSs ） are an excellent electrochemiluminescence（ECL ） material，which can produce ECL signals in both the anode and cathode when triethylamine（Et3N ） is used as a co-reaction reagent. It is interesting that the presence of dopamine （ DA ） quenches the anode signal ，but has no effect on the cathode signal. This phenomenon inspired us to build a dual-potential ratiometric ECL biosensor combined with molecularly imprinted polymer（ MIP ） for the detection of DA. The nanocomposites of g-C3N4NSs and multi-walled carbon nanotubes（ MWCNTs ） were immobilized on the surface of glassy carbon electrode （ GCE ） and then a molecularly imprinted film was introduced by electrochemical polymerization of O-phenylenediamine（ O-PD ） in the presence of DA. The cavities formed after eluting DA were used for specific recognization of DA. The sensitive and selective detection of DA was realized by taking advantage of the different effects of DA on the anode and cathode signals of the sensor. The sensor has a linear response to the DA concentration in a range from 1.0×10-10 to 3.0×10-7 mol ·L-1 with a low detection limit（ LOD ） of 0.063 nmol ·L-1（signal to noise ratio S/N=3）. The reproducibility and accuracy of this ratio method are greatly improved，compared with the non-ratio method.
Key words：dual-potential ratiometric detection；
electrochemiluminescence（ECL）；
carbon nitride nanosheets（g-C3N4NSs ）；
molecular imprinted polymer（MIP ）；
dopamine（DA ）
0 引言
多巴胺（DA ）是一种由大脑分泌的儿茶酚胺类神经递质物质[1]，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质.若 DA 水平偏低，则会引发一些神经疾病，如精神分裂症、亨廷顿病和帕金森病[2]，DA 水平偏高会导致精神兴奋和血压升高.因此，DA 含量的检测对于这些疾病的诊断、监测、预防和治疗具有非常重要的意义.目前，检测 DA 的方法包括荧光法（FL ）[3]、化学发光法[4]、电化学发光法（ECL ）[5]、差分脉冲伏安法（ DPV ）[6]、循环伏安法（CV ）[7]等.然而，它们大多存在一些缺陷，如成本高、耗时长、预处理繁琐、易受仪器和环境干扰等.
双电位比率 ECL 法是利用发光物质在不同电位下，发光信号的比值与待测物质含量之间的关系来进行定量分析的一种方法[8-9].相比于传统的单信号检测技术，比率检测技术能够矫正因电极、仪器和环境变化带来的影响，从而提高检测结果的准确度.
分子印迹聚合技术是以目标分子作为模板，通过聚合反应，合成分子印迹聚合物（MIP ）[10-12].除去膜板分子后留下形状、大小与目标分子互补的三维空腔结构，这些三维空腔可以高选择性地结合目标分子，从而实现对目标分析物的高选择性检测[13-14].将比率 ECL 发光与高选择性的 MIP 相结合，不仅可以改善灵敏度和选择性，还可以避免环境干扰，提高检测准确度.
石墨相氮化碳纳米薄片（g-C3N4NSs ）具有优良的 ECL 性能，在阴阳两极都能产生 ECL 信号，而 DA 可以极大猝灭其阳极信号，而阴极信号不变.依据这个原理，结合 MIP 技术，构建了一种 MIP-ECL 传感器，实现了对 DA 的高灵敏、高选择的准确检测.实验中，在 g-C3N4NSs 材料中加入多壁碳纳米管（ MWCNTs ），将其混合后固定在电极上，再引入 MIP. MWCNTs 的加入提高了 g-C3N4NSs 的發光强度和稳定性，MIP 对 DA 的特异性识别排除了其他共存物质的干扰，改善了选择性，比率法检测矫正了仪器和环境变化带来的影响，提高了检测结果的准确度.值得注意的是，这种双电位比率法只需要一个 ECL 物质，相比于那些由两个发光物质构成的体系，这个单一物质的体系更简单，干扰更少.
1 实验部分
1.1 实验试剂
三聚氰胺（C3H6N6）、三乙胺（Et3N ）、DA、邻苯二胺（O-PD ）均购于上海 Aladdin 公司；
磷酸二氢钾（ KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、无水乙醇、盐酸（HCl）均购于国药集团化学试剂有限公司；
MWCNTs 购于河南濮阳永新科技有限公司；
氯化钾（KCl）购于上海润捷股份有限公司.所有药品均是分析纯级，溶液以去离子水配制.
1.2 实验仪器
ECL 分析系统，西安瑞迈分析仪器责任有限公司，MPI-A/B；
电化学工作站，上海辰华仪器有限公司，660E；
数字化 pH 计，上海洛奇特电子设备有限公司，PHS-25；
马弗炉，上海慧泰仪器制造有限公司， PRD-C3000；
数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司，KQ-100DE；
恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂，GZX-DH-X；
离心机，上海安亭科学仪器厂，TGL-16C；
恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，95-I；
透射电子显微镜（TEM ），日本电子公司，JEOL 2100；
X 射线光电子能谱（XPS ），美国PE 公司，ULVCA-PHI；
恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂，GZX-DH-X.
三电极工作系统：以玻碳电极（GCE ）为工作电极，银/氯化银（Ag/AgCl）电极（饱和KCl溶液）为参比电极，铂（Pt ）丝为对电极.
1.3 g-C3N4NSs 的合成
g-C3N4NSs 是先合成体相氮化碳（g-C3N4），再经过酸化剥离而得到[15].具体方法为：1）称7.5 g C3H6N6固体放入坩埚，马弗炉600℃灼烧3 h，取出后自然降温，得到淡黄色 g-C3N4固体，研磨，备用；
2）取2.0 g 合成好的 g-C3N4固体粉末，加入100 mL 浓 HCl，搅拌6 h，用蒸馏水抽滤洗涤至 pH=7.0，收集产物，烘箱60℃干燥4 h；
3）取50 mg 产物，加50 mL 超纯水，超声2 h，5000 r ·min-1离心6 min，去除未剥离的块状 g-C3N4，取上层白色溶液，烘干即得 g-C3N4NSs，使用时，分散为质量浓度为1.0 mg·mL-1的溶液.
1.4 g-C3N4NSs/MWCNTs 复合物的制备
1）制备羧基化的 MWCNTs：取1.25 g MWCNTs 与12 mL 混酸（即98% H2SO4（质量分数）和65% HNO3（质量分数）以体积比为3∶1的比例混合）混合，60℃搅拌3 h，自然冷却至室温，用超纯水洗涤至 pH=7，50℃真空干燥12 h，得羧基化的 MWCNTs；
2）取一定量羧基化 MWCNTs，在超纯水中分散，得到0.1 mg ·mL-1羧基化 MWCNTs；
3）将上述制备的1.0 mg ·mL-1的 g-C3N4 NSs 分散液与0.1 mg ·mL-1羧基化 MWCNTs 按照10∶1（体积比）比例充分混合，超声30 min，得到 g-C3N4NSs 与 MWCNTs 的复合物，记为 g-C3N4NSs/MWCNTs.
1.5 MIP-ECL 传感器的构建
如图1所示，将 GCE 用粒径为0.5μm 三氧化二铝（Al2O3）粉末打磨 GCE 至光滑，再用无水乙醇与去离子水（体积比为1∶1）洗涤电极，超声5 min，自然晾干.取6.0μL g-C3N4NSs/MWCNTs 混合液滴涂于 GCE 表面，自然晾干，即得 g-C3N4/MWCNTs/GCE.把 g-C3N4/MWCNTs/GCE 电极置于含有2 mmol ·L-1 DA 和6 mmol·L-1 o-PD 的0.1 mol ·L-1磷酸盐缓冲溶液（PBS ）溶液中（pH=7.0），在0～0.8 V 电压范围内循环扫描15圈，在电极表面引入 MIP.然后，将电极浸入95%乙醇（质量分数）与水的混合溶液中（体积比为4∶1），静置15 min，除去模板分子 DA，得到能特异性识别 DA 的 MIP-ECL 传感器，用相同的方法制备了非分子印迹传感器（NIP-ECL ），用于对比实验.
1.6 ECL 检测
用 ECL 分析仪，采用三电极系统，修饰电极作为工作电极，Pt 丝电极为对电极（辅助电极），Ag/AgCl 电极为参比电极.将该电极系统插入0.1 mol ·L-1 PBS （pH=7.0，含有30 mmol·L-1 Et3N ）溶液中，在-1.2～+1.5 V 电压范围内，以100 mV·s-1的扫描速率进行循环扫描，记录 ECL 信号（光电倍增管为-600 V）.检测 DA 时，先将 MIP-ECL 传感器插入不同浓度的 DA 溶液中，孵育10 min 后取出，用去离子水清洗干净，再插入检测底液，根据阳极与阴极 ECL 信号的比值（I/I0）对 DA 进行定量检测.
2 结果与讨论
2.1 g-C3N4NSs-Et3N 体系的双电位 ECL 表征
在上述 ECL 检测条件下，测试了 g-C3N4NSs-Et3N 体系的 ECL 信号，如图2所示.该体系在阳极（+1.48 V ）和阴极（-1.20 V）产生了2个 ECL 信号，因此可以用来构建比率型传感器.
2.2 传感器的表征
分别采用电化学阻抗（EIS ）、循环伏安（CV ）以及 ECL 方法对不同修饰电极，包括 GCE，C3N4/ GCE，C3N4/MWCNTs/GCE，MIP/C3N4/MWCNTs/GCE 及洗脱 DA 和重新孵育 DA 后的电极进行了表征.
图3（a）为不同电极在1 mmol ·L-1铁氰化钾溶液（[ Fe （ CN ）6]3-/4-，含0.1 mol ·L-1 KCL ）的 EIS 谱图（图3（b）为图3（a）部分图的放大图），与裸电極
图2 g-C3N4NSs-Et3N 体系的双电位 ECL 信号图
GCE （黑线1）相比，C3N4/GCE （红色2）的电阻值（Rct ）有所增大，主要是因为 g-C3N4具有半导体性质，阻碍部分电子转移，表明 g-C3N4薄膜已成功固定到电极表面.当 MWCNTs 修饰到电极表面（蓝线3）时，Rct变小，主要是因为 MWCNTs 优良的导电性能，加速了电子转移.随着 MIP 的引入（橙线4），Rct急剧增加，表明非导电的 MIP 膜成功引入电极表面.当 DA 洗脱后（粉线5），电子转移通道被打开，Rct变小.重新孵育 DA 后（绿线6），Rct再次增加，这是因为电子传递通道再次被堵塞.
图3（c）为不同修饰电极在同样条件下的 CV 曲线图.可以看出，其结果与 EIS 结果相吻合.
图3（d）是不同修饰电极的 ECL 信号.与裸 GCE 相比，C3N4/GCE （黑线1）表现出很强的 ECL 响应，表明 g-C3N4具有较高的 ECL 活性.引入 MWCNTs（蓝线2）后，ECL 信号进一步增强.然而，引入 MIP（粉线3）膜后，ECL 信号显著降低，这由2个因素引起：一个是 DA 对 g-C3N4的 ECL 的猝灭效应；
另一个是 MIP 膜对电子转移的阻碍作用.当目标分子从电极上洗脱后（红线4），ECL 信号再次增加.由于同样的原因，孵育 DA 后（绿线5） ECL 信号再次降低.
以上结果证明，传感器的构建是成功的，而且对 DA 具有良好的响应，可用于 DA 的选择性检测.
2.3 实验条件优化
ECL 信号受诸多因素影响，包括 PBS 缓冲溶液的 pH 值、共反应剂 Et3N 的浓度以及目标分子 DA 的洗脱时间和孵育时间，分别对以上因素进行了考察，结果如图4所示.
图4（a）为 PBS 的 pH 值在6.0～9.0范围内对 ECL 信号的影响.当 pH 从6.0增加到7.0时，ECL 信号逐渐增大，在 pH=7.0时，达到最大，之后随着 pH 值的进一步增加，ECL 强度减小.因此，本实验选择 pH 值为7.0.
图4 不同检测条件对 ECL 影响.（a）检测底液的 pH 值；
（b）共反应剂 Et3N 的物质的量浓度；
（c） DA 的洗脱时间；
（d） DA 重新孵育时间第1期顾雄文，王彦，杨敏丽：基于g-C3N4-Et3N 体系的双电位比率MIP-ECL 传感器检测多巴胺35
图4（b）表示了共反应剂 Et3N 的物质的量浓度对 g-C3N4NSs/Et3N 体系阳极与阴极ECL 信号比值的影响.随着 Et3N 物质的量浓度的增加，阳极与阴极 ECL 信号比值迅速增加，当 Et3N 物质的量浓度超过30 mmol ·L-1后，阳极与阴极 ECL 信号比值并没有明显的变化.这是因为刚开始时，由于发光物质 g-C3N4NSs 含量过多，需要大量共反应剂 Et3N 才能产生更强的 ECL 信号，当 Et3N 增加到一定量时，由于 g-C3N4NSs 是定量的，过量的共反应剂不会导致 ECL 信号的增加.本实验选择共反应剂 Et3N 的物质的量浓度为30 mmol ·L-1.
图4（c）是 DA 洗脱时间的优化.将电化学聚合后的 MIP/C3N4/MWCNTs/GCE 电极浸泡在乙醇和水（体积比为4∶1）的混合溶液中，进行洗脱.记录不同洗脱时间对应的 ECL 信号.结果表明，当洗脱时间从3 min 增加到15 min 时，ECL 信号不断增加，15 min 后信号基本保持不变，说明 MIP 膜内的 DA 已达平衡状态，此时信号达到最大值.因此，模板分子 DA 最佳洗脱时间为15 min.
图4（d）是 DA 孵育时间的优化.将除去模板分子后的电极浸泡在2μmol·L-1的 DA 溶液中进行孵育，记录不同孵育时间对应的 ECL 信号.由图4（d）可知，ECL 信号随着孵育时间的延长而降低，在10 min 后降到最低且保持不变，说明10 min 后孵育达到平衡.因此，选择10 min 作为最佳孵育时间.
2.4 傳感器对 DA 的 ECL 响应
在上述优化条件下，测试了 DA 对所制备的 MIP-ECL 传感器的 ECL 响应，结果如图5（a）所示.随着 DA 物质的量浓度的增大，体系的阴极 ECL 强度没有发生明显的变化，而阳极 ECL 强度逐渐降低.因此，可将阴极信号作为参比值（I0），阳极信号作为变化值（I），通过 I/I0对 DA 进行定量.
由图5（b）可知，I/I0与 DA 物质的量浓度的对数值在0.1～300 nmol·L-1的范围内呈良好的线性关系.线性回归方程为 I/I0=-0.8937 lg C-4.4841，其中 C 为 DA 的物质的量浓度（mol·L-1）.检出限（LOD ）为0.063 nmol·L-1（信噪比 S/N 为3），相关系数 R2=0.9976.与其他检测 DA 的方法相比，本实验的方法具有较低的 LOD 和较宽的线性范围，如表1所示.
图5 传感器对 DA 的 ECL 响应.（a）比率传感器对不同物质的量浓度的 DA 的 ECL 响应；
（b）比率传感器的 ECL 比值与 DA 物质的量浓度的对数关系
2.5 传感器选择性、稳定性和重现性的考察
为考察传感器的稳定性，在-1.2～+1.5 V 连续循环电位扫描10个周期，如图6（a）所示，传感器阴阳两极的 ECL 强度并没有发生明显的变化，表明传感器具有良好的稳定性.将制备的 MIP-ECL 传感器放入4℃冰箱保存，每隔一周测试 ECL 信号，储存6周后，传感器的 ECL 强度保持了原来97%左右的强度，表明所构建的传感器存储稳定性良好，如图6（b）所示.相同条件下，平行制备了6个传感器，同样条件下测试它们的 ECL 信号，相对标准偏差（RSD ）为1.9%，表明传感器再现性良好，如图6（c）所示.
为检测传感器对 DA 的选择识别能力，选取了几种常见共存物，包括葡萄糖（Glc）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、柠檬酸（CA ）、尿酸（UA ）、抗坏血酸（AA ）、肾上腺素（AD ）和去肾上腺素（NE ），考察了传感器对它们的响应情况，如图6（d）所示，共存物浓度为 DA 浓度的20倍，这些共存物对 DA 不产生影响，表明所制备的 MIP-ECL 传感器对 DA 的选择性良好.
2.6 比率法与非比率法的 RSD 比较
为了验证比率法是否能提高检测方法的重现性和检测结果的准确度，分别采用比率法（以阳极信号与阴极信号的比值定量）和非比率法（以阳极信号定量）对不同物质的量浓度的 DA 进行平行检测，比较其 RSD，如图7所示，可以看出比率法的 RSD 要明显低于非比率法，证明比率法能提高方法的重现性，自然也能提高检测结果的准确度.
3 结论
本实验基于 g-C3N4NSs 的双电位 ECL 信号，及 DA 对其阳极信号的猝灭作用，构建了一种检测 DA 的比率 ECL 传感器.为了提高传感器的灵敏度和选择性，在传感器构建过程中，将具有良好导电性和大比表面积的 MWCNTs 掺入 g-C3N4NSs 中，同时引入对 DA 具有高识别能力的 MIP 膜，大大改善了传感器的灵敏度和选择性.与常见的由2种发光物质或2个工作电极构成的比率体系相比较，该体系最大的优点是只用了一个发光物质和一个工作电极，体系组成及仪器结构都更加简单，操作也更方便.实验结果也证明，所构建的传感器对 DA 表现出良好的选择性响应，和单信号的非比率法相比较，比率法的重现性有较大提高.
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（責任编辑：郁慧，包震宇）
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