张竞，周志艳，李丹丹，安丽康，王岩勃，邹卫
1.河北冀兆联科技发展有限责任公司，河北 石家庄 050051；
2.河北省药品医疗器械检验研究院，河北 石家庄 050200；
3.石家庄沃泰生物科技有限公司，河北 石家庄 050018；
4.河北科技大学，河北 石家庄 050018
重组人脑利钠肽是一种通过重组DNA 技术合成的、相对分子质量为3 464 的多肽，与心室肌产生的内源性多肽有相同的序列和空间结构，因此有相同的生物活性［1］。研究表明，补充几倍甚至十几倍的外源性脑利钠肽时，能迅速有效治疗心力衰竭，改善预后［2-3］。目前，国内外由脑利钠肽开发的新型药物均已上市。但在该药物质量研究过程中，等电点（isoelectric point，pI）的检测一直是技术瓶颈。重组人脑利钠肽pI 为10.9，超出了常规测定方法的pI 范围，不论采用凝胶电泳还是毛细管电泳，检测结果均不理想［4-6］。
1992年发展起来的新一代全柱成像毛细管等电聚焦电泳（capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection，CIEF-WCID）是一种将毛细管等电聚焦电泳（CIEF）和全柱成像检测结合起来的技术［7-16］。其中CIEF 将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将供试品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH 梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自的pI 时变为中性形成聚焦的区带［17］，当样品进行等电聚焦检测时，互补性金属氧化物半导体（compIementary metal-oxide-semicondu-ctor translator，CMOS）作为成像检测技术，可对整个聚焦分离通道、聚焦过程进行实时监控和记录，该过程中不移动毛细管柱，也无须移动样品［18］。因此可大幅度缩短检测时间，提高检测灵敏度。
本研究采用CIEF-WCID 法对两性电解质、占位剂、蛋白浓度、聚焦条件等进行优化［19-23］，获得检测重组人脑利钠肽pI 的最佳条件，并对建立的方法进行验证［24-25］及初步应用。
1.1 主要试剂及仪器 重组人脑利钠肽理化对照品（批号：20130601）及3批样品（批号：20161001、2016-1002、20161101）购自石家庄沃泰生物科技有限公司；
氢氧化钠（分析纯）购自天津市致远化学试剂有限公司；
精氨酸（分析纯）购自美国Sigma 公司；
毛细管分离柱、全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪CE Infinite、两性电解质HR AESlyte 8-10.5 和9-11、阳极电解液、阴极电解液、pI标记物、1%甲基纤维素溶液购自加拿大AES公司。
1.2 方法建立
1.2.1 样品制备
1.2.1.1 两性电解质选择 加入35 μL理化对照品和60 μL 1%甲基纤维素，各0.8 μL pI 标记物10.10 和10.45，8 μL两性电解质（HR AESlyte 8-10.5或9-11），超纯水补齐至200 μL，10 140×g离心5 min。
1.2.1.2 占位剂选择 加入35 μL理化对照品和60 μL 1%甲基纤维素，各0.8 μL pI标记物10.10和10.45，8 μL 两性电解质HR AESlyte 8-10.5，不同浓度占位剂（15、20、25 mmol／L氢氧化钠或5、10、20 mmol／L精氨酸），超纯水补齐至200 μL，10 140×g离心5 min。
1.2.1.3 蛋白浓度的选择 加入不同体积（2.4、4.5、9.0、17.5 μL）理化对照品（使重组人脑利钠肽终浓度分别为12、22.5、45 和87.5 μg／mL）和60 μL 1%甲基纤维素，各0.8 μL pI标记物10.10和10.45，8 μL两性电解质HR AESlyte 8-10.5，占位剂25 mmol／L氢氧化钠，超纯水补齐至200 μL，10 140×g离心5 min。
1.2.2 CIEF-WCID 条件 在样品制备条件优化完成的基础上，继续进行聚焦条件的摸索。采用自动进样方式，每次进样前用50 μL 0.2%甲基纤维素冲洗毛细管；
聚焦电压和时间：第1次聚焦1 000 V 1 min、第2 次聚焦2 000 V 1 min、第3 次聚焦3 000 V 分别6、8、10 min；
图像采集间隔设置为20 s；
样品池温度设置为8 ℃。
1.3 方法验证
1.3.1 重复性 按照1.2项优化后的方法制备1份样品进行检测，连续进样6次，计算相对标准偏差（RSD）。
1.3.2 样品间精密度 按照1.2项优化后的方法制备6份样品，分别进行检测，计算RSD。
1.3.3 耐用性 按照1.2 项优化后的方法制备样品，调整蛋白浓度分别为50、87.5 和125 μg／mL，分别进行检测，每个样品重复进样3次，计算RSD。
选择3 组pI 标记物（9.46／9.77、9.77／10.10和10.10／10.45），按照1.2项优化后方法制备样品，进行检测，每个样品重复进样3 次，计算RSD；
按照1.2 项优化后的方法制备样品，分别于0、1、3、5 h 进行检测，计算RSD。
1.4 方法的初步应用 取连续生产的3 批重组人脑利钠肽，按照1.2 项优化后的方法进行样品制备及检测，考察结果一致性。
1.5 数据分析 用CEInsight 软件采集数据，Clarity软件处理数据。
2.1 方法的建立
2.1.1 两性电解质选择 用HR AESlyte 8-10.5 可正常检测出1 个pI 标记物，其余样品未检出；
用HR AESlyte 9-11 获得的的图谱基线波动大，无法正常检测出重组人脑利钠肽的pI。见图1。推测HR AESlyte 8-10.5与待测样品pI不同，使样品易跑出毛细管柱，因此选择HR AESlyte 8-10.5 作为两性电解质，后续加入占位剂继续试验。
图1 不同两性电解质HR AESlyte 8-10.5（A）和HR AESlyte 9-11（B）的CIEF-WCID图谱Fig.1 CIEF-WCID profile of different amphoteric electrolytes HR AESlyte 8-10.5（A）and HR AESlyte 9-11（B）
2.1.2 占位剂选择 加入精氨酸后，待测样品峰被遮挡，依然仅有2 个pI 标记物的峰，不能检出待测样品峰；
加入氢氧化钠后，重组人脑利钠肽峰可聚焦检测到，并且随着氢氧化钠浓度的升高，其离右侧边界越远。见图2。为了检测的稳定性，选择25 mmol／L氢氧化钠作为占位剂。
图2 不同占位剂样品的CIEF-WCID图谱Fig.2 CIEF-WCID profile of different space-occupying agent samples
2.1.3 蛋白浓度选择 确定占位剂和两性电解质后，选择的4种蛋白终浓度（87.5、45、22.5和12 μg／mL）建立的检测方法均具有较好的灵敏度和重复性，但随着蛋白浓度的降低，电泳图会向右发生偏移，见图3。因此选择最大适宜浓度87.5 μg／mL 作为样品终浓度。
图3 不同蛋白浓度样品的CIEF-WCID图谱Fig.3 CIEF-WCID profile of samples with different protein concentrations
2.1.4 聚焦条件 3 种聚焦时间各峰峰形均无变化，在第3 次聚焦6 min 时已完成检测，见图4。确定聚焦条件为：1 000 V 1 min→2 000 V 1 min→3 000 V 6 min。
图4 不同聚焦时间下样品的CIEF-WCID图谱Fig.4 CIEF-WCID profile of samples under different focu sing times
最终确定检测重组人脑利钠肽CIEF-WCID法的条件为：两性电解质HR AESlyte 8-10.5、占位剂25 mmol／L氢氧化钠、样品浓度87.5 μg／mL、聚焦电压及时间：1 000 V 1 min →2 000 V 1 min →3 000 V 6 min。
2.2 方法验证
2.2.1 重复性 同一样品6 次检测pI 分别为10.86、10.87、10.87、10.86、10.87和10.85，平均值为10.86，RSD为0.1%；
等电聚焦电泳图峰形均无明显变化，见图5。表明方法重复性良好，可满足试验要求。
图5 重复性验证的CIEF-WCID图谱Fig.5 CIEF-WCID profile for verification of repeatability
2.2.2 样品间精密度 6份样品pI分别为10.85、10.86、10.85、10.86、10.86、10.86，平均值为10.86，RSD为0.1%。等电聚焦电泳图峰形均无明显变化，见图6。表明方法精密度良好，可用于重组人脑利钠肽的检测。
图6 精密度验证的CIEF-WCID图谱Fig.6 CIEF-WCID profile for verification of precision
2.2.3 耐用性
2.2.3.1 对蛋白浓度的耐用性3种浓度下检测pI的RSD为0.1%，见表1；
等电聚焦电泳图峰形均无明显变化，见图7，耐用性良好。
图7 样品浓度耐用性验证的CIEF-WCID图谱Fig.7 CIEF-WCID profile for verification of durability of sample concentration
表1 样品浓度耐用性的验证结果（pI）Tab.1 Verification for durability of sample concentration（pI）
2.2.3.2 对pI标记物的耐用性 9.46／9.77和9.77／10.10 的pI 标记物组合均不能检测出重组人脑利钠肽的pI，仅能应用10.10／10.45 的pI 标记物进行检测，见图8。
图8 pI标记物耐用性验证的CIEF-WCID图谱Fig.8 CIEF-WCID profile for verification of durability of pI marker
2.2.3.3 对样品进样时间的耐用性 0、1、3、5 h 4个时间点pI分别为10.87、10.87、10.87、10.86，平均值为10.87，RSD为0.1%；
等电聚焦电泳图峰形均无明显变化，图9。耐用性良好。
图9 进样时间的耐用性验证CIEF-WCID图谱Fig.9 CIEF-WCID profile for verification of durability of injection time
综上所述，建立的方法对蛋白浓度、样品进样时间耐用性良好，但pI标记物不可随意更换。
2.3 方法的初步应用 3 批样品等电聚焦电泳图谱一致，与理论pI结果一致，可用于重组人脑利钠肽pI的检测，见图10。
图10 重组人脑利钠肽样品pI检测的CIEF-WCID图谱Fig.10 CIEF-WCID profile of pI detection of recombinant human brain natriuretic peptide samples
本研究通过对两性电解质、占位剂、蛋白浓度以及聚焦时间等条件的摸索，获得了CIEF-WCID 法的主要参数及检测条件后，用于重组人脑利钠肽pI 的分析。
在CIEF技术中，两性电解质通常用于产生pH梯度。当在混有两性电解质的样品上施加电压时，pI最低的两性电解质（负电荷最多）向阳极移动，pI 最高的两性电解质（正电荷最多）向阴极移动。其他两性电解质会根据它们的pI值将溶液缓冲至相应的pH，而这个结果会是一个连续的pH范围。为了实现对蛋白的成功分离，根据pH 范围和强度选择的两性电解质是重要参数之一。由于重组人脑利钠肽pI为10.9，呈极碱性，现有pI标记物不能将其包含进去，因此选则离该pI 最近的1 组pI 标记物10.10、10.46。为达到样品与pI 标记物最好的分离效果，选择不同范围的两性电解质HR AESlyte 8-10.5 和9-11 进行优化，最终确定将HR AESlyte 8-10.5作为两性电解质。
由于整根毛细管充满了两性电解质和样品溶液，因此聚焦在毛细管出口端的极碱性蛋白质在迁移过程中无法被检测到。需要在样品加入占位剂，用于占据毛细管出口端的位置，避免发生极碱性蛋白聚集在检测窗口之后的现象。本研究选择精氨酸和氢氧化钠作为占位剂，其中精氨酸选择5、10、20 mmol／L 3 个浓度，NaOH 选择15、20、25 mmol／L 3 个浓度，进行筛选。最终确定加入25 mmol／L 氢氧化钠作为占位剂。
在相同的样品体系和聚焦条件下，蛋白质溶解度也不相同。当蛋白浓度过高时，溶解度低的蛋白会沉淀，从而导致电泳图峰型变差，重现性降低；
溶解度高的蛋白也会因样品过载而导致分辨率下降。但另一方面，蛋白浓度也不能过低，才可达到足够的检测灵敏度。经试验，确定87.5 μg／mL 作为样品终浓度。在样品配制条件优化完成的基础上，继续进行了聚焦条件的摸索，最终确定择1000 V 1 min →2 000 V 1 min →3 000 V 6 min为聚焦条件。
为确认建立的方法适用于相应检测要求，本研究进行了方法验证。重复性可测定同一份均匀供试品经多次测定所得结果间的接近程度［17］。耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为建立的方法用于常规检验提供依据［17］。开始研究分析方法时，应考虑其耐用性，本实验选取了蛋白浓度、pI标记物和样品进样时间3个影响因素进行耐用性考察，结果显示，该方法重复性好、精密度高。
由于重组人脑利钠肽的pI 过高，导致其分析方法存在不稳定性。而本研究建立的CIEF-WCID法经验证后，可准确、稳定地进行pI检测。为进一步确认该方法的可靠性，选择连续生产的3 批重组人脑利钠肽进行检测，均可稳定检测pI，表明建立的方法可用于重组人脑利钠肽pI 检测，为后续重组人脑利钠肽质量标准的建立提供了参考。
综上所述，本研究建立的CIEF-WCID法可稳定、准确地检测出脑利钠肽这一极碱性多肽的pI，也证明了该方法可测定极端pI 多肽，对于生物技术药物质量标准的建立具有重要意义。
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