李漂，刘艳红，刘晓琳，杨艾，张茜，鲁卫东
昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500
脂质体（liposome）具有载体装载量大、可靶向输送、制剂保护可靠性高、生物相容性好、结构可灵活改变及调控等优点，已广泛应用于多种药物，以提高治疗效果［1］。2，3-二油氧基丙基-三甲基氯化铵［N-1-（2，3-dioleyloxy）propyl-N，N，N-trimethylam-moniumchloride，DOTAP）］是一种常用的阳离子试剂，用于DNA 体外和体内的转染［2］。1，2-二油酰基磷脂酰胆碱（1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC）是一种中性磷脂，用不同质量比的DOTAP 及DOPC进行电荷修饰，可调节脂质体的Zeta 电位，使其带有不同强度的电荷［3］。经DOTAP修饰的阳离子脂质体是一种良好的免疫佐剂，可增强机体免疫应答，同时诱导更强的Th1细胞免疫应答［4］。研究表明，DOTAP修饰的载药脂质体进入体内，可诱发更少的炎症因子反应，且具有更好的靶向性和生物相容性［3，5-6］。带有不同表面电荷的脂质体可使单核细胞发生不同程度活化，诱导产生CD86 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［7-8］。
本研究制备不同电荷修饰（不同DOTAP／DOPC质量比）的流感疫苗脂质体，检测理化性质，观察其稳定性；
并用制备的流感疫苗脂质体免疫小鼠，检测其细胞及体液免疫效果，评价其免疫原性，以期为新型疫苗佐剂的研发奠定基础。
1.1 疫苗 H1N1、H3N2、B（V）及B（Y）型流感疫苗原液（批号分别为：201910001、201911001、201911-003、201912005，血凝素含量分别为：299、282、223、147 μg／mL，蛋白含量分别为：692.1、549.0、602.0、371.0 μg／mL）均由江苏沃森生物技术有限公司提供。
1.2 主要试剂及仪器 大豆卵磷脂购自北京美亚斯磷脂技术公司；
胆固醇及Folin 酚蛋白定量试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
DOTAP及DOPC 均购自美国Avanti 公司；
Anti-mouse CD4PE及Anti-mouse CD8a FITC 均购自美国eBiosciencee 公司；
MTT 购自北京博奥拓达科技有限公司；
激光粒度仪购自美国布鲁克海文仪器公司。
1.3 实验动物 SPF级KM小鼠，231只，雌性，8周龄，体质量18～22 g，由昆明医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为：SCXK（滇）2015-0002。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且通过昆明医科大学实验伦理审查委员会的审查。
1.4 电荷修饰流感疫苗脂质体的制备 将H1N1 型、H3N2 型、B（V）型、B（Y）型流感疫苗原液用PBS 稀释至血凝素含量为36 μg／mL，按等体积分数混合，制备为四价流感疫苗。以大豆卵磷脂、胆固醇、DOTAP和DOPC（DOTAP与DOPC质量比为1∶4、2∶3、3∶2、4∶1）为膜材，溶于无水乙醇，溶解后旋转蒸发至成膜状；
加入PBS缓冲液30 mL，50 ℃水化旋转，间歇超声，50 ℃水浴孵育，冷却至常温，即为4 种阳离子脂质体。将四价流感疫苗与4种阳离子脂质体按1.4∶1.0的体积分数混合，采用冻融-冻干法将混合液制备为电荷修饰的流感疫苗脂质体冻干粉［9］。
1.5 电荷修饰流感疫苗脂质体理化性质的检测
1.5.1 粒径及Zeta电位 用PBS复溶脂质体冻干粉，再用PBS 按1∶30 的体积分数稀释，于室温条件下，采用激光粒度仪测量粒径及Zeta电位。
1.5.2 脂质体包封率 用PBS 复溶脂质体冻干粉，于4 ℃，42 500 ×g离心1 h，采用Lowry 法测定包封率［10-11］。
1.6 电荷修饰流感疫苗脂质体免疫原性的检测
1.6.1 细胞免疫效果 将小鼠随机分为阴性对照组（PBS）、阳性对照组（四价流感疫苗原液）、阳离子脂质体组（4 种电荷修饰的流感疫苗脂质体）和中性脂质体组（未经电荷修饰的流感疫苗脂质体），每组15只。各组小鼠均经腹腔注射，0.2 mL／只，分别于免疫后7、14、28 d 各组分别取5 只小鼠，脱颈处死，无菌取脾脏。
1.6.1.1 MTT 法 将小鼠脾脏研磨制备为脾淋巴细胞悬液，用PBS 将脾淋巴细胞数调整为3.0 ×106个／mL，通过MTT 法测定细胞增殖情况，并计算刺激指数（stimulus index，SI），评价细胞增殖情况［9］。
1.6.1.2 T 淋巴细胞表面标记法 将小鼠脾脏研磨制备为脾淋巴细胞悬液，用PBS 将脾淋巴细胞数调整为3.0×106个／mL，采用流式细胞术检测脾淋巴细胞中CD4+、CD8+细胞百分比［9］。
1.6.2 体液免疫效果 按1.6.1 项进行动物分组，每组18 只，免疫剂量及途径同1.6.1 项。免疫后3、7、14、28、42、56 d，各组分别取3 只小鼠，经眼球采血，分离血清。采用血凝抑制（hemagglutinin inhibition，HI）试验检测抗体滴度，以免疫组抗体滴度与阴性对照组抗体滴度比（简称抗体滴度比）≥4 时判为具有免疫效应，比值越大表明免疫效应越强［10］。
1.7 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，细胞免疫效果数据均以均值± 标准差（x ± s）表示，各组间比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 电荷修饰流感疫苗脂质体的理化性质
2.1.1 粒径及Zeta 电位 随着DOTAP 与DOPC 质量比的增大，脂质体的粒径和Zeta 电位呈上升趋势，变化呈正相关，其中4∶1 组电荷最高，粒径最大。见表1。
2.1.2 包封率 DOTAP和DOPC质量比为1∶4、2∶3、3∶2、4∶1的脂质体包封率分别为89.00%、89.15%、56.07%和81.82%
2.2 电荷修饰流感疫苗脂质体的免疫原性
2.2.1 细胞免疫效果
2.2.1.1 MTT法 免疫后7、14、28 d，阳离子脂质体4个质量比组、中性脂质体组及阳性对照组（除14 d外）的SI均明显高于阴性对照组（F= 4.651～8.898，P均＜0.05），表明不同电荷修饰的阳离子脂质体能显著刺激脾淋巴细胞增殖，增强细胞免疫。随着免疫时间的增长，各组SI 均逐渐降低，7～14 d 时下降最快，14～28 d 时下降速度减缓。相同时间点，阳离子脂质体组中的3∶2、2∶3、1∶4 质量比组间SI 差异无统计学意义（F=0.351～1.037，P均＞0.05）；
4∶1质量比组的SI始终较高，产生细胞免疫原性较强，且7 d时，SI 明显高于其他比例组（F= 3.853～8.898，P均＜0.05），表明该组诱导早期细胞免疫的能力强于其他比例组，见表2。
表2 MTT法检测电荷修饰流感疫苗脂质体的细胞免疫效果（SI，±s，n=5）Tab.2 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by MTT assay（SI，±s，n=5）
表2 MTT法检测电荷修饰流感疫苗脂质体的细胞免疫效果（SI，±s，n=5）Tab.2 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by MTT assay（SI，±s，n=5）
注：与阴性对照组比较，a表示P ＜0.05，aa表示P ＜0.01；
与阳性对照组比较，b表示P ＜0.05，bb表示P ＜0.01。
组别阴性对照阳性对照阳离子脂质体（DOTAP与DOPC质量比）4∶1 3∶2 2∶3 1∶4中性脂质体7 d 1.044±0.029bb 1.135±0.022aa 1.455±0.014aa，bb 1.279±0.032aa，bb 1.224±0.024aa，bb 1.212±0.021aa，bb 1.155±0.042aa 14 d 0.997±0.085 1.038±0.119 1.223±0.142aa，bb 1.196±0.026aa，bb 1.179±0.086aa，b 1.130±0.032a 1.086±0.048 28 d 0.888±0.034bb 0.993±0.036aa 1.201±0.028aa，bb 1.121±0.024aa，bb 1.117±0.033aa，bb 1.110±0.048aa，bb 1.011±0.035aa
2.2.1.2 T淋巴细胞表面标记法 免疫后7、14、28 d，阳离子脂质体组4 个质量比组的CD4+／CD8+值均明显高于阴性对照组（F=9.882～25.866，P均＜0.05）。免疫后7 d，2∶3 质量比组的CD4+／CD8+值与阳性对照组比较，差异无统计学意义（F= 0.837，P均＞0.05），1∶4质量比组高于阳性对照组及中性脂质体组，但差异均无统计学意义（F分别为0.594和0.746，P＞0.05）；
免疫后14和28 d，阳离子脂质体4个质量比组的CD4+／CD8+值均明显高于阳性对照组及中性脂质体组（F=3.230～7.624，P均＜0.05）。免疫后7 d，4∶1 质量比组的CD4+／CD8+值明显高于其他组（F= 1.341～7.781，P＜0.05）；
免疫后14 和28 d，4∶1 质量比组的CD4+／CD8+值高于其他3 个组，差异无统计学意义（F= 0.305～0.675，P均＞0.05），但与阴性对照组、阳性对照组、中性脂质体组比较，差异有统计学意义（F= 4.706～7.463，P均＜0.05）。见表3。表明不同质量比阳离子修饰的脂质体能刺激脾淋巴细胞增殖，增强细胞免疫，整个免疫期内，电荷较高的4∶1 质量比组免疫增强作用最强。
表3 T淋巴细胞表面标记法检测电荷修饰流感疫苗脂质体的细胞免疫效果（CD4+／CD8+，±s，n=5）Tab. 3 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by T lymphatic surface labeling（CD4+／CD8+，±s，n=5）
表3 T淋巴细胞表面标记法检测电荷修饰流感疫苗脂质体的细胞免疫效果（CD4+／CD8+，±s，n=5）Tab. 3 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by T lymphatic surface labeling（CD4+／CD8+，±s，n=5）
注：aa表示与阴性对照组比较，P ＜0.01；
bb表示与阳性对照组比较，P ＜0.01。
组别阴性对照阳性对照阳离子脂质体（DOTAP与DOPC质量比）4∶1 3∶2 2∶3 1∶4中性脂质体7 d 1.755±0.040 1.892±0.232aa 2.438±0.115aa，bb 2.331±0.107aa，bb 2.227±0.067aa 2.111±0.040aa 2.085±0.190aa 14 d 1.704±0.032 1.776±0.092aa 2.383±0.088aa，bb 2.234±0.039aa，bb 2.251±0.034aa，bb 2.281±0.091aa，bb 1.997±0.029aa，bb 28 d 1.622±0.122 1.697±0.081aa 2.359±0.051aa，bb 2.203±0.030aa，bb 2.154±0.078aa，bb 2.032±0.060aa，bb 1.878±0.051aa，bb
2.2.2 体液免疫效果 免疫后3 d，阳性对照组及4∶1 阳离子脂质体组的抗体滴度比均＞4；
免疫后7 d，阳性对照组、4∶1 及3∶2 阳离子脂质体组、中性脂质体组抗体滴度比均＞4，且4∶1 质量比组高于其他3 组；
免疫后14 d，各组抗体滴度比均＞4，且4∶1 质量比组高于其他各组；
免疫后28 d，各组抗体滴度比均＞4，4∶1 质量比组高于阳性对照组及中性脂质体组，除4∶1 质量比组外的其他3 个比例组抗体效价达最高；
4个阳离子脂质体组均能刺激小鼠产生特异性血凝素抗体，整个免疫周期内均能检测到较高滴度的特异性抗体，4∶1 质量比组可以产生较快较强的体液免疫效应，见表4。综上所述，4∶1 质量比组于免疫后3 d即产生了早期体液免疫效果，免疫后42 d抗体滴度达最高，体液免疫效应达最大，且在整个免疫周期内均维持较高水平，表明4∶1 质量比的阳离子流感疫苗脂质体可诱导早期免疫能力更强，且免疫效应持久。
表4 HI 法检测电荷修饰流感疫苗脂质体的体液免疫效果（抗体滴度比均值，n=3）Tab. 4 Detection of humoral immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by HI assay（average antibody titer ratio，n=3）
目前，批准使用的佐剂种类较少，铝佐剂是公认的使用较多的一种佐剂，但其只能诱导体液免疫而不能诱导细胞免疫，且易诱发超敏反应［12-14］。阳离子脂质体作为一种药物载体和疫苗佐剂，目前尚处于开发的初级阶段。有研究表明，阳离子脂质体的免疫调节作用主要是由于其表面电荷密度，而不是阳离子脂质体的浓度，可通过静电吸附，与细胞更好地结合［15］。
本研究以四价流感疫苗为抗原，评价不同比例阳离子修饰（不同DOTAP 与DOPC 的质量比）脂质体的免疫增强作用，检测结果表明，4 种阳离子比例修饰的脂质体均表现出较好的佐剂性能，其中4∶1质量比组脂质体的粒径最大，电荷最强，其免疫增强作用也最佳，由此推断免疫增强效果与脂质体Zeta 电荷有一定相关性。有研究表明，表面带有更高正电荷的脂质体／基因复合物更易与细胞产生吸附作用，从而提高细胞摄入率［16-18］。HE 等［19］合成制备了3 种粒径相同但电荷不同的阳离子脂质体，细胞摄入试验结果表明，细胞摄入率与表面电荷呈正相关，即随着脂质体表面电荷的升高，细胞摄入率增加。但阳离子脂质体不仅要考虑结合率，还要考虑释放效率及安全性，阳离子电荷大小主要由季铵盐头部电荷决定，该基团也是产生细胞毒性最强的部位，表明脂质体所带电荷量越大，脂质体细胞毒性越大［20-22］。稳定性、安全性和有效性是阳离子脂质体佐剂应用于药物制备的重要指标［23-24］，有待进一步深入研究。
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