王金冬，马亚林，段招军
1.潍坊医学院基础医学院病原生物学教研室，山东 潍坊 261053；
2.中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 102206；
3.甘肃中医药大学公共卫生学院，甘肃 兰州 730000
人类诺如病毒（human norovirus，HuNoV）是一种无包膜的单正链RNA病毒，属于人类杯状病毒科（Caliciviridae）诺如病毒属。NoV 基因组大小为7 500 ～7 700 bp，包括5"和3"端非编码区以及3 个开放阅读框（open reading frames，ORFs）。ORF1 主要编码一种大的多聚蛋白，由病毒蛋白酶加工产生病毒复制所需的6 种非结构（non-structural，NS）蛋白，其中包括RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）［1］；
ORF2 和ORF3 分别编码主要衣壳蛋白VP1和次要结构衣壳蛋白VP2，VP1蛋白包含组织血型抗原（histo-blood group antigens，HBGAs）结合位点和关键中和表位，其可表达为独立于其他病毒组分的重组蛋白，在真核表达系统中自行组装形成病毒样颗粒（viral-like particle，VLP）［2-3］。ORF2 区包含S区和P区2个结构域，S区编码S蛋白（1 ～225 aa），构成病毒内壳；
P 区构成衣壳外的突起部分，由剩余氨基酸组成，可分为P1 和P2 两个亚区，P1 亚区相对保守，P2 亚区位于衣壳最外层，是NoV 与HBGAs 受体结合的关键区域，包含主要的抗原中和位点，同时具有高度变异性和高免疫原性［4-5］。当单独表达时，24 个P 区结构域可自发组装成T = 1 的八面体对称性的P 颗粒。P 颗粒可经原核系统大量表达，与受体的结合效果强于VLP和P二聚体［6］。
VP1 蛋白是NoV 分类的主要依据。根据VP1 氨基酸序列的不同，NoV 可被分为10 个基因型（GⅠ～GⅩ）［7］，其中，GⅡ.4 NoVs 是过去30 年引起NoV 急性胃肠炎暴发的最主要流行株。GⅡ.4 毒株具有高度变异性，每2 ～3 年即有新的变异株产生并取代旧的流行株，造成新一轮的暴发流行［8-9］。自1995 年以来，GⅡ.4 变异株已造成6 次大规模NoV 暴发，包括95／96 US 变异株、Farmington_Hills_2002 变异株和Hunter变异株等。GⅡ.4的变异和进化持续发生，陆续出现不同表型，目前我国的主要流行株为GⅡ.4 Sydney［P31］［10-11］。
VP1 蛋白决定NoV 的抗原性和毒株特异性，是探索NoV与HBGAs受体结合模式的关键蛋白。HBGAs是一类复合糖类，具有高度多态性，广泛存在于消化道、呼吸道和泌尿生殖道等黏膜上皮细胞的表面，以及血液、唾液、乳汁等体液中［12］。研究发现，NoV具有高度特异性，不同型别的NoV可能识别不同的HBGAs受体。多数GⅡ.4 NoVs 可与A、B、O 等分泌型HBGA受体结合［13］。蛋白-受体结合模式的探索不仅有助于了解NoV 的致病机理，也可为NoV 疫苗的研究提供支持。
本研究通过对目前我国NoV 的代表流行株——GZ19 的VP1 蛋白进行进化分析和关键氨基酸位点比对，深入探讨GⅡ.4 Sydney［P31］的进化规律，同时表达并制备GZ19 株的P 颗粒蛋白，分析其与HBGAs受体的结合特征，确定该毒株的宿主感染范围，为后期NoV疫苗的研发提供理论依据。
1.1 质粒、寡糖及细胞 携带NoV GZ19株（GenBank：OK148516）ORF2 序列的质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，P 区末端已引入CDCRGDCFC 修饰氨基酸基因序列以促进P 颗粒的形成；
带有生物素（Biotin）标签的寡糖：A 双糖（A-di）、B 双糖（B-di）、H 双糖（H-di）、H1、H2、H3、lewis a（Lea）、lewis b（leb）、lewis x（lex）、lewis y（ley）、唾液酸化lea（sLea）、唾液酸化lex（sLex）购自美国GlycoTech公司；
表达载体pGEX-6P-1 由中国疾病预防控制中心病毒性腹泻室保存；
大肠埃希菌Trans5α 和BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 唾液样本 人唾液样本（项目伦理号：IVDC2017-NO.023）由中国疾病预防控制中心病毒性腹泻室保存，HBGAs表型已明确。
1.3 主要试剂及仪器 3C蛋白酶和GST标签蛋白由中国疾病预防控制中心病毒性腹泻室保存；
鼠源Anti-GST单克隆抗体和HRP标记的山羊抗兔和抗小鼠IgG购自北京全式金生物技术有限公司；
兔源Antinorovirus VP1 多克隆抗体购自美国GeneTeX 公司；
HRP 标记的链霉亲和素购自美国Abcam 公司；
亲和层析柱和谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B 填料购自北京索莱宝科技有限公司。
1.4 进化分析和氨基酸位点比对 根据NoV GZ19株的VP1蛋白氨基酸序列，利用Mega 7.0软件，选取具有代表性的2012—2022年间流行的GⅡ.4 Sydney株构建NoV 进化树，采用Clustal W 和最大似然法进行比对和构建。同时对GⅡ.4 Sydney 株的HBGA 结合位点（HBGA binding sites，HBSs）和A-H 阻断表位的关键氨基酸进行比对，探讨GZ19 毒株与目前主要流行株以及GⅡ.4 Sydney 2012原型株之间的差异。
1.5 重组P颗粒表达质粒的构建 根据GZ19株基因序列，应用Primer Premier 5 软件设计扩增P 区的特异性引物，上游引物：5"-ATATggatccAAACCATTCTCTGT-3"（下划线为BamHⅠ酶切位点），下游引物：5"-CGCctcgagTTAGCAAAAGCAATC-3"（下划线为XhoⅠ酶切位点）。反应条件：94 ℃预变性5 min；
94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃1 min，共35个循环；
72 ℃延伸5 min。胶回收PCR 产物，连接至pGEX-6P-1 载体，将连接产物转化大肠埃希菌Trans5α感受态细胞。次日，随机挑取3个单克隆菌落，小量扩增后提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒送北京擎科新业生物技术有限公司测序。
1.6 P 颗粒的表达与纯化 将测序鉴定正确的重组表达质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，37 ℃培养12 ～16 h；
挑取单克隆于LB 培养基（含100 μg／mL氨苄青霉素）中，37 ℃，180 r／min培养过夜；
将菌液按1∶100转入新鲜LB培养液（含100 μg／mL氨苄青霉素）中继续培养，当菌液A600值达0.5 ～0.7时，加入终浓度为0.4 mmol／L的IPTG，22 ℃，150 r／min诱导过夜。收集菌体沉淀，加入PBS 重悬，冰水浴超声破碎，4 ℃，10 000×g离心后，分离上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE分析。
将谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B 填料介质与过滤后的上清混合，室温翻转1 ～2 h，使带有GST 标签的目的蛋白结合至介质上；
将结合后的混合液倒入GST亲和层析柱中，弃滤液，加入PBS 洗涤3 ～5 次，除去未与介质结合的杂质蛋白，并重新平衡介质；
将结合重组蛋白的介质吸出，加入100 μL 3C蛋白酶，4 ℃酶切过夜，去除GST 标签；
次日将介质吸出，再次加入亲和层析柱中，收集重组蛋白洗脱液，加入10 kDa Millipore 超滤管中，2 800 ×g离心30 min，弃去收集管中液体，过滤完成后加入PBS缓冲液，洗涤数次，最后将蛋白样品浓缩至2 ～3 mL，取样进行12% SDSPAGE分析，NanoDrop测定蛋白浓度。
1.7 P颗粒特异性的鉴定 采用间接ELISA法鉴定P颗粒的特异性。用PBS 缓冲液将纯化的P 颗粒稀释为0.25、0.5、1、2、4、8 μg／mL，各取100 μL 加入酶标板中，4 ℃包被过夜；
分别加入兔源Anti-norovirus VP1 多克隆抗体（1∶1 000、1∶2 000 和1∶4 000 稀释），37 ℃孵育1 h；
设GST 标签蛋白为阴性对照，加入鼠源Anti-GST 单克隆抗体（1∶2 000稀释），4 ℃孵育过夜；
0.5‰PBST 洗涤后各加入HRP 标记的山羊抗兔或抗鼠IgG（1∶10 000 稀释），37 ℃孵育1 h；
加入TMB 显色液，避光显色10 min；
1 mol／L 磷酸溶液终止反应，酶标仪读取波长450 nm处的吸光度值。
1.8 P颗粒的糖结合特征分析
1.8.1 唾液结合试验 将1∶1 000 稀释的唾液样本加入酶标板中，100 μL／孔，4 ℃包被过夜；
加入5%脱脂奶粉，37 ℃封闭2 h；
加入用PBS稀释成10 μg／mL的纯化P 颗粒，100 μL／孔，4 ℃结合过夜；
依次加入NoV VP1 多克隆抗体（1∶2 000 稀释）和HRP 标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000 稀释），37 ℃孵育1 h；
加入TMB 显色液，避光显色10 min；
1 mol／L 磷酸溶液中止反应，酶标仪读取波长450 nm处的吸光度值。
1.8.2 寡糖结合试验 将纯化的P 颗粒加入酶标板中，20 μg／孔，4 ℃包被过夜；
加入5%脱脂奶粉，37 ℃封闭2 h；
加入PBS 稀释的寡糖A-di、B-di、H-di、H1、H2、H3、Lea、Leb、Lex、Ley、sLea、sLex，0.2 μg／孔，4 ℃结合过夜；
加入HRP标记的链霉亲和素（1∶2 000稀释），37 ℃孵育1 h；
加入TMB显色液，避光显色10 min；
1 mol／L磷酸溶液终止反应，酶标仪读取波长450 nm处的吸光度值。
2.1 进化分析 根据NoV GZ19 株VP1 蛋白的氨基酸序列进行进化分析，结果发现，GⅡ.4 Sydney 自2012年出现至今，随着时间的推移不断发生变化，目前主要聚集于GⅡ.4 Sydney［P31］和GⅡ.4 Sydney［P16］两个谱系中。本研究选择的疫苗株GZ19来自于广州一所小学暴发性胃肠炎患者的粪便样本，经测序和序列分析，该毒株归类为GⅡ.4 Sydney［P31］谱系，其VP1 蛋白的氨基酸序列与GⅡ.4 Sydney 2012原型株（GenBank：KC175323）的同源性达98.7%，与2017—2022年其他GⅡ.4 Sydney［P31］主要流行株的VP1氨基酸序列一致性为97.5%～99.8%，与GⅡ.4 Sydney［P16］株的氨基酸序列同源性为94.6%～97.4%。见图1。
图1 基于VP1 蛋白氨基酸序列的GⅡ.4 Sydney 变异株系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of GⅡ.4 Sydney variant based on amino acid sequences of VP1 protein
2.2 VP1蛋白关键氨基酸位点分析 VP1蛋白上包含3个HBSs，分别为SiteⅠ（338 ～349位氨基酸）、SiteⅡ（370 ～376位氨基酸）和Site Ⅲ（440 ～446位氨基酸），均位于P结构域。对2012—2022年间GⅡ.4 Sydney株HBSs 的关键氨基酸比对发现，HBSs 具有高度保守性，与GⅡ.4 Sydney 2012 原型株相比，GZ19 株在SiteⅡ位点有两位氨基酸（372 和373）发生了突变，序列同源性为92.3%。自2015年以来，GⅡ.4 Sydney［P31］流行株的HBSs位点未发生明显改变，氨基酸序列同源性为100%。GZ19株与GⅡ.4 Sydney［P16］株（GenBank：LC153121，LC331997，MW661278）氨基酸序列一致性为92.3%，见图2A。
图2 GⅡ.4 Sydney株VP1蛋白的关键氨基酸序列分析Fig.2 Analysis of key amino acid sequences of GⅡ.4 Sydney VP1 protein
A-H 为NoV VP1 蛋白上重要的阻断表位，也是潜在的中和位点。不同型别的GⅡ.4 Sydne 毒株其阻断表位的氨基酸序列差异较大。与GⅡ.4 Sydney 2012原型株相比，GZ19株在A、B、D表位的氨基酸序列同源性分别为62.5%、50%和80%，其余表位同源性为100%。与2015年以来的其他GⅡ.4 Sydney［P31］流行株相比，GZ19 株在A、G 表位的氨基酸序列一致性分别为75%和83.3%，其余位点未检测到明显差异。与GⅡ.4 Sydney［P16］相比，GZ19株在A、D、E 和H表位分别显示出62.5%、80%、80%和50%的氨基酸同源性。见图2B。
2.3 重组表达质粒的鉴定 重组表达质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，可见4 984 bp 的pGEX-6P-1 载体条带和990 bp 的P 区条带，大小均与预期相符，见图3。测序结果证实，插入序列与目的基因完全一致，重组质粒构建正确。
图3 重组表达质粒的双酶切（BamHⅠ／XhoⅠ）鉴定Fig.3 Restriction map of recombinant expression plasmids（BamHⅠ／XhoⅠ）
2.4 表达及纯化产物的鉴定 12% SDS-PAGE 分析显示，在诱导后的菌液和破菌上清中可见相对分子质量约62 000 的GST-P 重组蛋白，见图4。经GST 纯化、酶切与浓缩，在相对分子质量约36 000处可见明显P 颗粒蛋白条带，见图5，蛋白纯度约为90%，浓度约为2 mg／mL。
图4 表达产物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of expressed product
图5 纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified product
2.5 P 颗粒的特异性 间接ELISA 结果显示，随着抗原包被浓度的增加，各实验组中NoV VP1 抗体测得的A450值也不断增加，平均值在0.2 ～2.0 之间；
阴性对照组中GST蛋白包被孔的A450值均低于0.1。见图6。表明纯化的P 颗粒蛋白与NoV VP1 抗体发生了特异性结合，进一步证实了P颗粒的正确表达。
图6 间接ELISA法鉴定GZ19株P颗粒的特异性Fig.6 Identification of characteristics of P particles of GZ19 strain by indirect ELISA
2.6 P颗粒的糖结合特征 唾液结合试验结果显示，GZ19 株P 颗粒可结合A、B、O、AB 等分泌型唾液样品，而与非分泌型样品不结合，见图7。寡糖结合试验表明，GZ19 株P 颗粒仅与H-di 寡糖结合，与其他寡糖未发生有效结合，见图8。
图7 GZ19株P颗粒的唾液结合特异性分析Fig.7 Saliva-binding specificity of GZ19 strain P particles
图8 GZ19株P颗粒的寡糖结合特异性分析Fig.8 Oligosaccharide-binding specificity of GZ19 strain P particles
NoV 具有高度多样性，根据VP1 氨基酸序列的不同，可分为10个基因型，其中，GⅡ.4 NoVs在全球范围内一直占据主导地位。发生在ORF2 区的基因突变以及ORF1和ORF2连接处的基因重组导致GⅡ.4 NoVs 不断进化并产生新的变异株，成为GⅡ.4 NoVs逃避群体免疫和大规模流行的关键［14］。GⅡ.4 Sydney株自2012 年出现以来一直在全球占据主导地位，其主要包括GⅡ.4 Sydney［P31］和GⅡ.4 Sydney［P16］两种类型。GⅡ.4 Sydney［P16］是由于聚合酶区重组而形成的新的变体，自2016 年出现以来在一些国家已取代了GⅡ.4 Sydney［P31］成为新的流行株［15-16］。但目前我国仍以GⅡ.4 Sydney［P31］株为主，GⅡ.4 Sydney［P16］总体检出率仅为0.35%［11，17］。作为目前我国NoVs 的主要流行型别，GⅡ.4 Sydney［P31］的受体结合特征分析为进一步的疫苗评价和基础研究提供了依据。
HBSs 是NoV 与HBGAs 受体结合的关键位点。通常情况下，同一型别的HBSs 相对保守，但在进化压力下，HBSs 某些氨基酸位点发生突变可能会影响NoV 与HBGA 的结合，进而导致NoV 受体结合特征的变化。通过对比发现，GZ19株与近5年的其他GⅡ.4 Sydney［P31］毒株的HBSs 氨基酸序列完全一致，而与GⅡ.4 Sydney 2012原型株以及近年流行的GⅡ.4 Sydney［P16］株在SiteⅡ位点上存在氨基酸差异，表明以GZ19 株为代表的GⅡ.4 Sydney［P31］NoVs 和GⅡ.4 Sydney原型株，以及GⅡ.4 Sydney［P16］株的受体结合模式可能存在差异。为了进一步验证此观点，本研究表达了GZ19株的P颗粒蛋白，并进行HBGAs 受体结合特征分析。在唾液结合试验中，GZ19 株显示出与其他GⅡ.4 NoVs相似的结合模式，即与A、B、O、AB型唾液样本结合，与非唾液样本不发生结合［18-19］，且GZ19 株与各型别的分泌型唾液均显示出较强的结合能力；
而寡糖结合试验中P颗粒仅与H-di 寡糖结合，与其他H 组寡糖不结合，这与前期报道的GⅡ.4 NoVs 可结合H 抗原（α-1，2 岩藻糖）不符［13］。考虑可能与人工寡糖的结构有关，本研究认为，相较于人工合成的低聚糖，唾液样本才能更好地反应不同唾液表型和与NoVs 的结合模式。因此，从上述结果可以看出，GZ19株显示出与其他GⅡ.4 NoVs相似的结合模式，即对占比80%的分泌型人群易感，这也是该毒株流行的主要原因之一。
位于VP1 蛋白上A-H 阻断表位是用人源和动物的单克隆抗体绘制的。除表位F 外，其余表位均位于P2 亚区的环上或颗粒表面，并与中和抗体、附着因子相互作用，因此也是潜在的中和表位［20-21］。A-H阻断表位的变化，特别是A、C和G几个关键表位的突变是导致GⅡ.4 变异株周期性出现的重要原因［22-23］。这些关键位点氨基酸的变化在一定程度上反应了病毒进化趋势。比对结果发现，GZ19 株与近5 年来的大部分GⅡ.4 Sydney［P31］流行株具有相似的阻断表位，而与GⅡ.4 Sydney 2012 原型株氨基酸差异较大，表明GⅡ.4 Sydney［P31］在不断进化。GZ19 株与GⅡ.4 Sydney［P16］株的关键氨基酸也存在较大差异，毒株之间是否存在交叉免疫，以及免疫保护效果的强弱有待进一步实验验证。
GⅡ.4 Sydney［P31］是目前我国NoVs 的主要流行型别，本研究通过分析2012年以来的GⅡ.4 Sydney［P31］毒株序列，以及比对HBSs 和A-H 阻断表位上的关键氨基酸，探索NoVs 的进化规律以及未来可能的进化趋势。GZ19 株是当前GⅡ.4 Sydney［P31］的代表毒株，通过GZ19 株P 颗粒与唾液及寡糖的结合试验，明确了当前GⅡ.4 Sydney［P31］流行株的糖结合特征，为进一步揭示GⅡ.4 Sydney［P31］的流行机制及监测该毒株的变异进化提供了思路，也为抗病毒药物和疫苗研发奠定了基础。
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