刘剑桥，张明媚，刘晓闯，霍星星，姜娟娟，李传润*
（1.安徽中医药大学第一附属医院 国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031；
2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230013）
类风湿关节炎是一种常见的慢性炎症性自身免疫性疾病，其主要病理特征是滑膜内膜增生，大量成纤维细胞样滑膜细胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLSs）活化。活化后的FLSs 表现出过度增殖以及凋亡减少的肿瘤样行为，通过与T 细胞、B 细胞、巨噬细胞以及多种细胞因子相互作用，分泌大量炎症细胞因子和分解代谢酶，形成持续的关节炎症[1]。在FLSs增生的慢性破坏下，类风湿关节炎病情逐步加重[2-3]，最终导致关节破坏，功能丧失[4]。因此，了解FLSs作为类风湿关节炎病理因素的分子机制对于治疗类风湿关节炎及相关疾病非常重要。佐剂型关节炎模型因其与人类类风湿关节炎发病过程类似，同样存在被激活的FLSs，并且制备方便、成模率高，被广泛用作类风湿关节炎研究的动物模型。
健脾化湿通络方是安徽中医药大学第一附属医院刘健教授在临床实践中，基于新安医学“脾虚致痹”“健脾化湿”理念创制的中药复方，由黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣组成。前期临床研究表明，健脾化湿通络方可抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞炎症反应，促进细胞凋亡，发挥治疗作用[5]。本研究首先建立佐剂型关节炎大鼠模型，通过分离培养佐剂型关节炎大鼠FLSs，观察健脾化湿通络方含药血清对FLSs 过度增殖的抑制作用和炎症水平影响，探究健脾化湿通络方治疗类风湿关节炎的作用机制。
1.1 实验动物
7 ～ 8 周龄SPF 级健康雄性SD 大鼠30 只，体质量为（250±10）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[许可证号：SCXK（鲁）20190003]。标准动物房饲养，室温为 22 ～24℃，湿度为50%～60%。实验方案经安徽中医药大学动物实验伦理委员会论证批准（许可证号：AHUCM-Rats-2021005）。
1.2 药品与试剂
健脾化湿通络方（组方：黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣；
饮片由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，经水煎后浓缩为含生药量为1.0 g/mL 的药液，冷藏保存）。CCK-8 检测试剂盒（批号：CR2112050）、DMEM 高 糖 培 养 基（批 号：GP21050050710）、D-Hank’s（批 号：GP2006080873）、PBS（批 号：GP20060701001），均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；
ELISA 定量检测试剂盒IL-1β（批号：RX302869R）、IL-10（批号：RX302880R）、IL-4（批号：RX302858R），均购自泉州市睿信生物科技有限公司；
胰酶（批号：C0201）、DAPI（批号：C1002）、Cy3 标记山羊抗兔IgG（H + L）（批号：A0516），均购自碧云天生物技术公司；
凋亡试剂盒（批号：BB20081，上海贝博生物科技有限公司）；
弗氏完全佐剂（批号：C13083712，上海麦克林生化公司）。
1.3 主要仪器
CytoFLEX 型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；
CKX53 型倒置显微镜[奥林巴斯（中国）公司]；
3111 型细胞培养箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；
RT6100 型酶联免疫检测仪（雷杜生命科学股份有限公司）；
JW-10 型离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；
LIOO XC20 型成像系统[奥林巴斯（中国）公司]。
2.1 模型组大鼠模型建立
大鼠适应性饲养一周后，随机分为正常组和模型组，每组10 只。第0 天，模型组大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL 弗氏完全佐剂，正常组大鼠注入液体石蜡。第8 天起每3 天测量左后足趾肿胀度（mL）。第20 天3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉大鼠，分离膝关节，多聚甲醛固定。于超净台中分离大鼠滑膜组织，分离培养原代FLSs。
2.2 膝关节组织HE 染色观察
将经过多聚甲醛固定的膝关节组织进行脱钙；
乙醇脱水，二甲苯透化；
石蜡包埋切片，66℃ 烤片20 ～30 min；
依次二甲苯、乙醇脱蜡；
苏木素浸染2 ～ 5 min，1%盐酸酒精分化后伊红染液浸染；
依次过苯酚-二甲苯、二甲苯I、II 透明；
中性树胶封片，显微镜观察结果。
2.3 含药血清制备
健脾化湿通络方经体表面积比值折算以相当于人临床等效用量0.324 mg/g 为基础给药剂量，大鼠以10倍剂量灌胃3.24 mg/g，每日2 次，连续给药3 d，末次给药1 h 后，腹主动脉取血，3 000 r/min 离心10 min分离血清，56 ℃水浴30 min 灭活，无菌操作分装，-80 ℃保存备用。
2.4 原代FLSs 培养与鉴定
分离模型组大鼠膝关节中滑膜组织；
4 ℃预冷的无菌D-Hank’s 液冲洗；
2 倍体积Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化2 h；
将组织块均匀置于培养瓶，加入1 ～ 2 mL 20%FBS 的DMEM 培养基；
免疫荧光法鉴定FLSs 特定波形蛋白（Vimentin）：破膜，血清室温封闭20 min，200 μL一抗（1∶200）4 ℃ 过夜孵育；
二抗（1∶500）37 ℃避光孵育30 min。200 μL DAPI 染液，室温避光孵育5 min。抗荧光淬灭封片剂封片，镜检拍照。FLSs 在含20%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中，5%CO2、37 ℃培养。
2.5 细胞实验分组
正常组：由正常组大鼠滑膜分离培养的滑膜细胞；
模型组：模型组大鼠滑膜中分离培养的FLSs；
给药组：模型组细胞经10%含药血清干预。
2.6 CCK-8 法评价健脾化湿通络方含药血清对FLS增殖能力影响
FLSs 以1×105个/mL 接种于96 孔板，5% CO2、37 ℃孵育过夜，选用前期实验确定的最佳含药血清浓度（10%含药血清）分别干预 0、24、48、72 h 后终止培养，每孔加入10 μL CCK-8，在酶联免疫检测仪450 nm 处测量各孔的吸光值（A）。细胞增殖率 =（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。
2.7 流式细胞术检测健脾化湿通络方含药血清对FLSs 凋亡影响
胰酶消化贴壁FLSs，收集0.5 ～ 1×106个细胞，1 500 r/min 离心3 min，弃上清。PBS 清洗2 次，按凋亡试剂盒说明书操作。用FlowJo VX 软件对流式细胞凋亡的图像进行分析，凋亡细胞数 = Q2 + Q3。
2.8 炎症因子水平检测
采用ELISA 方法，取FLSs 培养上清液，严格按照各试剂盒说明书进行操作，检测IL -1β、IL-4、IL-10 水平。
2.9 统计学方法
用SPSS 24.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
3.1 佐剂型关节炎大鼠模型建立
从造模第8 天模型组大鼠足趾肿胀度明显高于正常组（P＜ 0.01），并且在造模期间始终维持高肿胀度，见图1。
图1 模型足趾肿胀度（±s，n = 10）Fig.1 Swelling degree of toe in model（±s，n = 10）
光镜观察大鼠膝关节HE 切片，正常组大鼠关节腔内可见滑膜组织为2 ～ 3 层滑膜细胞组成，光洁平整，无增生和血管翳；
模型组大鼠关节腔内可见滑膜细胞过度增生，滑膜组织乳头状突起，褶皱，血管翳明显增多，见图2。综上表明佐剂型关节炎大鼠模型成功建立，可用于后续实验。
图2 HE 病理（×200）Fig.2 Pathological of HE（×200）
3.2 FLSs 分离培养及鉴定
原代滑膜细胞培养7 d 后，滑膜组织基本消失，大量滑膜细胞游离，呈卵圆形、梭形。经过三次传代，通过免疫荧光法检测波形蛋白（Vimentin）鉴定FLSs，波形蛋白表达阳性，呈梭形，细胞核清晰，呈椭圆形，位于细胞中央。波形蛋白的存在表明分离培养的细胞为FLSs，可用于后续实验，见图3。
图3 FLSs 鉴定（×400）Fig.3 Identification of FLSs（×400）
3.3 健脾化湿通络方含药血清对FLSs 增殖影响
与正常组相比，模型组12、24、48、72 h 细胞增殖率均明显上升（P＜0.01）；
与模型组相比，给药组细胞增殖率明显下降（P＜0.05），给药时间的延长增强了含药血清对FLSs 的抑制增殖作用，在10%含药血清干预72 h时FLSs的增殖率最低，见图4。
图4 健脾化湿通络方含药血清对FLSs 增殖影响（±s，n = 3）Fig.4 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on the proliferation of FLSs cells（±s，n = 3）
3.4 健脾化湿通络方含药血清对FLSs 凋亡的影响
流式细胞术检测凋亡细胞结果见图5、图6，模型组与正常组相比，模型组凋亡细胞明显减少（P＜0.01）；
给药组和模型组比较，给药组凋亡细胞明显增加（P＜0.01）。
图5 流式细胞术检测健脾化湿通络方含药血清对FLSs 凋亡的影响（±s，n = 3）Fig.5 Effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on apoptosis of FLSs by flow cytometry（±s，n = 3）
图6 健脾化湿通络方含药血清对FLSs 凋亡的影响（±s，n = 3）Fig.6 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum medicated serum on the apoptosis of FLSs（±s，n = 3）
3.5 健脾化湿通络方含药血清对FLSs 中IL-1β、IL-10 、IL-4 表达的影响
ELISA 结果显示，模型组与正常组相比，模型组IL-1β、IL-4 的表达水平明显升高（P＜0.01），IL-10 的表达水平明显下降（P＜0.05）；
健脾化湿通络方含药血清干预后，给药组与模型组相比，IL-1β、IL-4 表达水平明显下降（P＜0.01，P＜0.05），IL-10 表达水平明显上升（P＜0.01），见图7。
图7 健脾化湿通络方含药血清对FLSs 细胞因子表达的影响（±s，n = 3）Fig.7 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on the expression of FLS cytokines（±s，n = 3）
FLSs 在慢性炎症环境下激活导致滑膜组织增生与滑膜炎症，是类风湿关节炎重要的病理特征。本研究在佐剂型关节炎大鼠中发现FLSs 激活，表现出过度增殖、凋亡减少，炎症相关细胞因子异常表达，HE 观察到大鼠软骨表面粗糙破坏，滑膜血管翳明显增多，滑膜组织乳头状增生，这与类风湿关节炎病理特征一致。
IL-1β、IL-4 和 IL-10 等细胞因子的异常表达，形成了FLSs 激活需要的慢性炎症环境。这些细胞因子在免疫应答过程中由免疫细胞分泌，在促进炎症、抑制炎症和细胞生长等方面起到重要作用。IL-1β是重要的促炎因子，由类风湿关节炎患者关节滑膜液中巨噬细胞分泌，在滑膜液中高表达[6]，本研究在模型组中检测到IL-1β 的明显高表达，给药组干预后表达明显降低。IL-4 和IL-10 具有抑炎作用，可抑制T 细胞、单核巨噬细胞分泌炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-17 以及多种趋化因子，在类风湿关节炎中起到抑制炎症作用[7-9]，本研究中模型组中IL-4 表达升高，可能与疾病活动时IL-4 的负反馈调节有关，含药血清干预后IL-4 表达降低与治疗后炎症水平下降趋势一致；
健脾化湿通络方含药血清可以显著提高模型组IL-10 表达，发挥抗炎作用。综上所述，降低IL-1β 表达，增强IL-10 表达是健脾化湿通络方治疗类风湿关节炎的作用机制之一。
临床研究显示，健脾化湿通络方通过改善类风湿关节炎患者关节疼痛和炎症反应，明显提高类风湿关节炎患者的生活质量[10]；
健脾化湿通络方通过调节信号通路影响促炎细胞因子的表达，促进成纤维细胞样滑膜细胞凋亡[11-12]。健脾化湿通络方的有效成分研究中，臣药雷公藤中Macroregelines 成分对类风湿关节炎病人滑膜细胞有明显的抗增殖作用；
蜈蚣中的多肽可以通过调节T 淋巴细胞减轻炎症和关节损伤[13-14]。这些研究共同证明了健脾化湿通络方通过抑制FLSs发挥抗类风湿关节炎作用。
本研究从FLSs 的过度增殖这一类风湿关节炎的主要病理表现角度探讨了健脾化湿通络方在动物模型中作用的可能机制。通过检测FLSs 在健脾化湿通络方干预后凋亡水平和炎症因子水平变化，确定抑制FLSs 的过度增殖，降低炎症因子表达是健脾化湿通络方治疗佐剂型关节炎的一种可能机制。但作为体外实验，本实验结果具有一定的局限性，有待于通过体内实验进一步验证。
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