赵佩佩，孙亚磊，张厦，袁斌
南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029
呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一种单链负极性包膜RNA病毒，属副黏液病毒科[1]。流行病学调查显示，RSV是世界范围内引起儿童下呼吸道感染的常见病原体，其利用宿主免疫并引起强烈的炎症反应，从而导致肺损伤和病毒传播[2-3]。RSV肺炎可见于出生后任何阶段，1～6个月婴儿可见较重病例，是世界范围内3岁以内儿童发病和死亡的主要原因[4]。研究表明，病毒感染宿主后，诱导宿主产生多种抗病毒反应，包括固有免疫和适应性免疫等，激发先天性免疫细胞（主要是吞噬细胞）内的模式识别受体识别病毒的模式病原，开始一系列复杂的信号级联反应，诱导Ⅰ型干扰素（IFN）表达，进一步激活下游JAK/STAT 信号通路及干扰素激活反应元件（ISRE），诱导干扰素刺激基因（ISGs）转录，发挥抗病毒作用[5-6]。
清肺口服液是全国名中医汪受传教授结合RSV证候特点，在麻杏石甘汤基础上加前胡、桑白皮、葶苈子、虎杖等组方而成，具有开肺化痰、解毒活血功效，是南京中医药大学附属医院院内制剂。课题组前期研究发现，清肺口服液中占比最大的黄酮类成分可能通过调控Ⅰ型IFN信号通路发挥抗RSV作用，并通过液相色谱-质谱联用技术鉴定出26个化合物，经过定量分析得到能激活Ⅰ型IFN信号通路的黄酮类组分[7]。实验研究发现，清肺口服液中黄酮类成分通过调节PI3K/AKT 和NF-κB 信号通路蛋白表达，抑制RIP1/RIP3/MLKL/PGAM5/DRP1 介导的坏死性凋亡和TLR4/MyD88/p38 MAPK 信号通路，从而抑制炎症因子释放，减轻RSV 导致的肺部炎症和上皮屏障损伤[8-11]。同时，RSV感染可抑制宿主细胞IFN基因转录，干扰机体正常的抗病毒免疫反应，清肺口服液中黄酮类成分可上调抗病毒蛋白表达，改善RSV 导致的代谢紊乱[8]。基于此，本实验进一步以前期筛选出的可激活Ⅰ型IFN信号通路的黄酮类组分为研究对象，观察其对RSV感染小鼠IFN-α介导的JAK1/STAT1信号通路的影响，探讨其发挥抗RSV作用的机制。
1.1 动物
SPF级雌性BALB/c小鼠36只，4～6周龄，体质量16～18 g，上海杰思捷实验动物有限公司提供，动物合格证号20180004054465，生产许可证号SCXK（沪）2018-0004。饲养于温度（23±2）℃、相对湿度40%～70%、昼夜交替照明环境。本实验经南京中医药大学实验动物伦理委员会审批。
1.2 RSV病毒
RSV Long株，储存于江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，利用人喉癌上皮细胞复苏，扩增，收集，并检测其毒力，备用。
1.3 药物及制备
清肺口服液黄酮类组分包括：牡荆素（货号ST00340120，纯度≥98.0%）、槲皮素（货号ST00230120，纯度≥98.0%）、山柰酚（货号ST00450120，纯度≥98.0%）、芫花素（货号ST04150120，纯度≥98.0%）、芹菜素（货号ST00410120，纯度≥98.0%），上海诗丹德标准品公司；
异鼠李素（货号BCY000856，≥98.0%），江西佰草源生物科技公司。按照前期定量结果[7]组合，按牡荆素∶异鼠李素∶槲皮素∶山柰酚∶芫花素∶芹菜素=1∶1.16∶1.18∶2.24∶1.43∶3.76比例称取各对照品，用0.5%羧甲基纤维素钠配制成浓度分别为0.3%、0.6%、1.2%混悬液，超声震荡使其充分溶解，备用。利巴韦林颗粒，50 mg/袋，批号1023508，四川百利药业公司。
1.4 试剂与仪器
兔抗小鼠Janus 酪氨酸蛋白激酶1（JAK1）抗体（美国CST，批号3344S），兔抗小鼠信号传导与转录激活因子1（STAT1）抗体（美国CST，批号14994S），兔抗GAPDH抗体（美国CST，批号2118S），山羊抗兔多克隆二抗（美国CST，批号7074P2），BCA蛋白定量试剂盒（上海西唐，批号WB101-96T），DEPC水（上海碧云天，批号R0021），HE染色液（武汉赛维尔，批号G1003），RIPA 裂解液（上海碧云天，批号P0013B），TRIzoI（南京迅贝，批号15596-018），SDS-PAGE 凝胶试剂盒（上海翌圣生物，批号20325ES62），IFN-α ELISA试剂盒（上海西唐，批号F10640-96T），ECL超敏显色试剂盒（上海翌圣生物，批号36208ES76）。
ChemiDocTM蛋白印迹-多功能成像系统（美国Bio-Rad公司），PowerPac Basic电泳仪/湿转膜仪（美国Bio-Rad公司），MM400混合球磨仪（德国Retsch公司），Olympus BX51 倒置显微镜（日本Olympus 公司），Infinite M200 多功能酶标仪（瑞士TECAN 公司），BioPhotometer D30 蛋白核酸分析仪（德国Eppendorf公司），Quant Studio 7 Flex PCR System（美国Life Technologies公司）。
2.1 分组、造模及给药
36只小鼠适应性饲养7 d，随机分为正常组、模型组、利巴韦林组和清肺口服液黄酮类组分低、中、高剂量组（黄酮组分低、中、高剂量组），每组6 只。第8～9日，除正常组外，其余组用异氟烷麻醉，经鼻予RSV病毒液90 μL。第10～13日，给药组分别予利巴韦林溶液（50 mg/kg）或清肺口服液黄酮类组分混悬液（30、60、120 mg/kg）灌胃，正常组和模型组灌胃等量生理盐水。末次给药后禁食不禁水，第14日颈椎脱臼处死小鼠，收集血清，分离肺组织，保存备用。
2.2 HE染色
取肺组织，经4%多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，石蜡包埋，切片，常规HE染色，脱水，透明，封片，显微镜下观察肺组织炎症情况。
2.3 ELISA检测
取小鼠血清，按试剂盒说明书对标准品进行逐级稀释，加样，孵育，洗涤，显色，终止反应，酶标仪进行检测，计算血清IFN-α含量。
2.4 RT-PCR检测
取肺组织，加入TRIzol试剂，球磨仪研磨，取上清液，加入氯仿，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，提取总RNA。检测总RNA 浓度并进行反转录，得到cDNA，利用荧光定量PCR 仪检测RSV-F、JAK1 和STAT1 mRNA 表达，以GAPDH 为内参进行标准化，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，引物序列见表1。
表1 各基因PCR引物序列
2.5 Western blot检测
称取20 mg肺组织，加入裂解液和蛋白酶、磷酸酶抑制剂混合液，充分研磨，提取肺组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性，配胶，电泳，转膜，封闭，滴加JAK1、STAT1、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加二抗常温孵育1 h，TBST洗膜，曝光，Image J软件检测蛋白灰度值。
2.6 免疫组化染色
肺组织经多聚甲醛固定后，脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片，常规脱蜡，水化，抗原修复，清除内源性过氧化物酶，封闭，分别加一抗、二抗孵育，辣根过氧化物酶显色，复染，脱水封片，显微镜下观察。以棕色颗粒为阳性表达，Image J 软件计算JAK1 和STAT1阳性表达的平均光密度。
采用Graphpad Prism 7.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
4.1 黄酮类组分对模型小鼠肺组织病理形态的影响
正常组小鼠肺组织结构正常，肺泡腔内未见充血、水肿及炎性渗出；
模型组小鼠肺组织充血明显，伴大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主；
利巴韦林组和黄酮组分各剂量组小鼠肺组织病理损伤状况均明显改善。见图1。
图1 各组小鼠肺组织形态（HE染色，×200）
4.2 黄酮组分对模型小鼠血清α干扰素含量的影响
与正常组比较，模型组小鼠血清IFN-α含量增加（P＜0.001）；
与模型组比较，利巴韦林组和黄酮组分低、中剂量组小鼠血清IFN-α含量减少（P＜0.001），黄酮组分高剂量组IFN-α含量增加（P＜0.05）。见表2。
表2 各组小鼠血清IFN-α含量比较（±s，pg/mL）
表2 各组小鼠血清IFN-α含量比较（±s，pg/mL）
注：与正常组比较，###P＜0.001；
与模型组比较，*P＜0.05，***P＜0.001
IFN-α 15.66±1.03 27.26±0.76###17.39±0.60***16.87±0.79***21.01±1.30***30.36±1.31*组别正常组模型组利巴韦林组黄酮组分低剂量组黄酮组分中剂量组黄酮组分高剂量组只数666666
4.3 黄酮组分对模型小鼠肺组织呼吸道合胞病毒-F、Janus酪氨酸蛋白激酶1和信号传导与转录激活因子1 mRNA表达的影响
与正常组比较，模型组小鼠肺组织RSV-F、JAK1和STAT1 mRNA表达明显升高（P＜0.01）；
与模型组比较，利巴韦林组及黄酮组分各剂量组RSV-F mRNA表达明显降低（P＜0.05），利巴韦林组及黄酮组分低剂量组JAK1和STAT1 mRNA表达明显降低，黄酮组分高剂量组JAK1和STAT1 mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。
表3 各组小鼠肺组织RSV-F、JAK1和STAT1 mRNA表达比较（±s）
表3 各组小鼠肺组织RSV-F、JAK1和STAT1 mRNA表达比较（±s）
注：与正常组比较，##P＜0.01；
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
STAT1 1.00±0.00 3.19±0.73##1.20±0.05**1.51±0.19*2.16±0.12 4.87±1.10**组别正常组模型组利巴韦林组黄酮组分低剂量组黄酮组分中剂量组黄酮组分高剂量组只数666666 RSV-F 0 22.3±7.68##10.15±3.77*6.36±0.91*3.45±1.13*2.70±0.44*JAK1 1.00±0.00 3.33±0.76##1.26±0.09**1.54±0.17*2.22±0.12 5.46±1.11*
4.4 黄酮组分对模型小鼠肺组织Janus酪氨酸蛋白激酶1和信号传导与转录激活因子1蛋白表达的影响
Western blot结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肺组织JAK1和STAT1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.001）；
与模型组比较，利巴韦林组和黄酮组分中剂量组JAK1和STAT1蛋白表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05），黄酮组分高剂量组JAK1和STAT1蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见图2、表4。
图2 各组小鼠肺组织JAK1和STAT1蛋白免疫印迹
表4 各组小鼠肺组织JAK1和STAT1蛋白表达比较（±s，相对灰度值）
表4 各组小鼠肺组织JAK1和STAT1蛋白表达比较（±s，相对灰度值）
注：与正常组比较，###P＜0.001；
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
STAT1 0.12±0.01 0.99±0.15###0.54±0.06*0.88±0.13 0.55±0.07*1.16±0.11*组别正常组模型组利巴韦林组黄酮组分低剂量组黄酮组分中剂量组黄酮组分高剂量组只数666666 JAK1 0.06±0.01 0.92±0.19###0.38±0.05**0.73±0.13 0.46±0.07**1.22±0.11*
免疫组化结果结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肺组织JAK1和STAT1表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001）；
与模型组比较，利巴韦林组JAK1和STAT1表达明显降低（P＜0.01），黄酮组分各剂量组JAK1和STAT1表达有上升趋势，其中黄酮组分高剂量组差异有统计学意义（P＜0.001，P＜0.01）。见表5、图3、图4。
图3 各组小鼠肺组织JAK1阳性表达（免疫组化染色，×200）
图4 各组小鼠肺组织STAT1阳性表达（免疫组化染色，×200）
表5 各组小鼠肺组织JAK1和STAT1表达比较（±s，平均光密度）
表5 各组小鼠肺组织JAK1和STAT1表达比较（±s，平均光密度）
注：与正常组比较，#P＜0.05，###P＜0.001；
与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001
STAT1 9.00±2.65 23.67±3.22###11.33±3.22**39.33±1.53***26.67±2.08 48.00±4.58***组别正常组模型组利巴韦林组黄酮组分低剂量组黄酮组分中剂量组黄酮组分高剂量组只数666666 JAK1 16.00±1.00 25.00±2.00#18.33±2.52**26.67±2.31 28.00±3.46 37.00±2.00**
天然免疫也称固有免疫、非特异性免疫，是生命体在长期进化过程中逐渐形成的免疫防御机制，是抵抗病原微生物感染的第一道防线[12-13]。黄酮类化合物存在于多种中药中，具有广泛的抗炎、抗病毒及调节机体免疫功能等作用[14-16]。研究发现，黄酮类化合物经肠道梭状芽孢杆菌代谢后的代谢产物脱氨基酪氨酸能与干扰素-α/β受体（IFNAR）结合，激活Ⅰ型IFN信号通路，从而激活下游JAK/STAT信号通路，诱导大量ISGs转录，增强小鼠清除病毒的能力，减轻肺部炎症损伤，从而降低流感病毒感染的死亡率[17]。JAK/STAT信号通路作为Ⅰ型IFN信号通路的重要组成部分，一些病毒可通过抑制JAK/STAT信号通路mRNA和蛋白表达，阻碍IFN信号传递，抵御IFN系统，影响抗病毒效果[18]。研究表明，RSV可抑制JAK/STAT信号通路活性并降低IFN-β表达，从而降低宿主的天然抗病毒免疫反应[19]。金欣口服液能通过上调Ⅰ型IFN 相关蛋白如p-STAT1、p-STAT2表达，发挥抗病毒作用[20]。Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2 可促进IFN-α 诱导的JAK/STAT1信号通路，抑制RSV复制[21]。
课题组前期实验研究表明，清肺口服液中黄酮类成分具有减轻RSV感染小鼠炎症损伤和上皮屏障损伤作用。基于前期研究成果，本实验建立RSV感染小鼠模型，发现模型组小鼠肺组织充血明显，伴有大量炎性细胞浸润。RSV-F是RSV复制的关键蛋白，其表达量可直接反映RSV 复制能力，模型组肺组织RSV-F mRNA高表达，提示模型建立成功；
黄酮组分各剂量组和利巴韦林组小鼠肺组织炎症损伤均有不同程度改善，RSV-F mRNA表达明显下调，表明清肺口服液黄酮类组分对RSV感染小鼠有一定的抗炎和抑制RSV复制作用。IFN-α作为机体天然免疫系统的关键因子，通过与IFNAR结合，从而激活下游JAK/STAT信号通路，上调下游抗病毒蛋白和基因表达，发挥抗病毒作用。IFN-α具有多种生物活性，可调节机体免疫环境，增强淋巴细胞对病毒的杀灭作用。重组人干扰素α1b可提高RSV感染小鼠体内JAK/STAT通路活性，发挥抗RSV效应[22]。本实验对血清IFN-α含量进行检测发现，模型组小鼠血清IFN-α含量明显增加，说明RSV能激活Ⅰ型IFN通路，黄酮组分高剂量组血清IFN-α含量较模型组明显增加，说明高剂量黄酮组分可上调RSV小鼠血清IFN-α水平，进一步激活RSV感染小鼠Ⅰ型IFN通路，激活天然免疫系统。而与模型组相比，利巴韦林组及黄酮组分低、中剂量组IFN-α含量减少，说明其不能激活Ⅰ型IFN信号通路。分子实验研究发现，黄酮组分高剂量组能升高IFN-α 下游JAK1 和STAT1 mRNA及蛋白表达，说明其可能通过激活IFN-α/JAK1/STAT1信号通路，增强小鼠天然免疫系统功能，发挥抗RSV作用。
综上所述，清肺口服液黄酮类组分可以发挥抗小鼠RSV感染作用，其机制可能与上调IFN-α表达，激活JAK1/STAT1 信号通路，增强机体天然免疫功能有关。
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