吴晓青，刘永静，孙燕丽
1. 福建生物工程职业技术学院（福州 350007）；
2. 福建中医药大学（福州 350122）
橄榄（Canarium albumRaeusch）为橄榄科橄榄属乔木植物的果实，呈青色、卵圆形，所以也称为青果，药食同源[1]。我国橄榄种植资源极为丰富，福建、广东、广西、云南、海南、台湾和浙江等均有橄榄分布和栽培[2]。橄榄的功效成分种类和含量丰富，其中多酚类物质是橄榄最重要且含量最高的功效成分，也是影响橄榄鲜食品质的核心指标之一[3]。橄榄多酚具有抗菌、抗病毒、解热、抗肿瘤、降血压、降血脂及免疫调节等作用[4-6]。目前，橄榄多酚主要用甲醇、丙酮、乙醇等有机溶剂提取，安全性较差，且会污染环境[7]。低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）是由两组或三组低共熔混合物分别作为氢键供体（Hydrogen Bond Donor，HBD）和氢键受体（Hydrogen Bond Acceptor，HBA），按照一定化学计量的摩尔比通过氢键之间的相互作用组合而成的，常用的氢键受体多为季铵盐，如氯化胆碱或甜菜碱等，而氢键供体多为醇类、酰胺、糖类及羧酸等[8]。DES是继离子液体之后的又一新型的绿色溶剂，具有无毒、易生物降解、原料成本低、合成简单等优点，因这一系列独特的性质使得其在萃取天然产物领域的潜力逐渐为人们所重视[9-11]。目前，DES在提取天然植物生物活性成分如黄酮[12-13]、多酚[14-16]、生物碱[17]、皂苷[18]、多糖[19]等方面已有一定的应用。
超声辅助提取法是应用超声波强化提取植物的有效成分，操作简单，可以采用不同溶剂以满足不同目标物提取的需要，尤其可以在低温下操作，非常适宜热敏性物质的提取。故此研究以橄榄为原料，探究超声辅助低共熔溶剂法提取橄榄多酚，以橄榄中的多酚得率为评价指标，在低共熔溶剂的种类、摩尔比、含水量、液料比、超声时间和超声温度等单因素考察基础上，采用响应面法进一步优化超声辅助低共溶剂提取工艺，并以抗坏血酸为阳性对照，通过1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除试验，评价橄榄多酚的抗氧化活性，为橄榄多酚的深入研发提供一种可供借鉴的提取新方法奠定基础。
1.1 材料与试剂
橄榄（福建闽清）；
纯度≥98%没食子酸（上海源叶生物科技有限公司）；
氯化胆碱、丙二醇、丙三醇、乙酰胺、乙醇、福林酚、无水碳酸钠、L(+)-抗坏血酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
乙二醇、丁二醇、丙二酸（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；
乳酸、脲（分析纯，西陇科学股份有限公司）；
DPPH（分析纯，索莱宝生物科技有限公司）。
1.2 仪器与设备
UV1800PC-DS2紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；
AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；
TGL-16M高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；
101A-2电热鼓风恒温干燥箱（上海东星建材试验设备有限公司）；
KQ-600GKDV高功率恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
SHA-B恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；
DS-1高速组织捣碎机（上海精科实业有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 DES的制备
将溶剂氢供体与氢受体按表1所示摩尔比进行混合，于80 ℃恒温水浴中，磁力搅拌直至形成均一的溶液后，用去离子水稀释，得到含水量为30%的DES，冷却至室温，备用。
表1 DES配制表
1.3.2 橄榄多酚的提取方法
取橄榄鲜果，洗净，去核，在60 ℃热风干燥至恒重，粉碎过0.425 mm筛备用。精密称取1 g处理后的橄榄粉末，加入低共熔溶剂，在一定温度下，超声处理（功率600 W）一定时间后，以5 000 r/min离心10min取得上清液，即得橄榄多酚提取液。
1.3.3 多酚得率的测定
采用课题组前期优化的福林酚（Folin-ciocalteu，FC）比色法测定橄榄多酚含量[20]。精确称取0.1 g没食子酸，加蒸馏水稀释至25 μg/mL，得到没食子酸对照品溶液。精密量取1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL没食子酸对照品溶液，用蒸馏水稀释适量后的橄榄多酚提取液1.0 mL置刻度离心管中，加3.0 mL FC试剂、4.0 mL 10% Na2CO3溶液，加水稀释至25.0 mL，摇匀，在40℃恒温水浴中反应45 min后，在765 nm波长条件下测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标，没食子酸质量浓度X（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程Y=0.134X+0.010 2，r=0.999 7，没食子酸在1.008 0～5.040 0 μg/mL范围内具有良好的线性关系。根据标准曲线计算橄榄多酚质量浓度，并按式（1）计算橄榄多酚得率。
式中：C为回归方程计算出的质量浓度，μg/mL；
m为样品质量，g；
V为测定时反应体系总体积，mL；
N为稀释倍数。
1.3.4 单因素试验
采用1.3.2小节方法提取橄榄多酚，以不同比例的DES-1为提取溶剂，考察不同的提取条件下橄榄多酚得率。单因素试验设计如表2所示。
表2 单因素试验表
1.3.5 响应面设计试验
在单因素试验的基础上，确定氯化胆碱/乙二醇摩尔比1∶4，选取重要影响因素含水量、液料比、超声时间和超声温度4个因素为变量，运用响应面分析软件的 Box-Behnken模型，以橄榄多酚得率为响应值进行响应面试验分析，确定多酚提取最佳提取工艺条件。响应面因素编码及各自变量水平见表3。
表3 响应面因素水平设计
1.3.6 DPPH清除能力的测定
分别取适量1.3.2小节方法所得两种橄榄多酚提取液以及抗坏血酸，用无水乙醇稀释成系列浓度的待测液。在比色管中分别加入2.0 mL待测液与2.0 mL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，混合均匀，暗处放置30 min后，在517 nm波长处测定其吸光度A1。同时，将2.0 mL不同浓度的待测液与2.0 mL无水乙醇充分混合反应后测定其吸光度A2，将2.0 mL DPPH乙醇溶液和2.0 mL无水乙醇充分混合反应后测定其吸光度A0。根据式（2）计算待测液的DPPH清除率。采用SPSS软件拟合，求出IC50值。
式中：A1为加入待测溶液后的吸光度；
A2为待测溶液的本底吸光度；
A0为空白对照溶液的吸光度。
1.3.7 数据处理
采用SPSS 24.0软件进行数据分析，Origin 2021软件进行作图，通过Design Expert 10.0.3软件进行响应面试验处理。
2.1 DES类型的选择
以液料比20∶1 mL/g、超声功率600 W、超声温度40 ℃、超声波辅助提取30 min作为橄榄多酚提取条件，8种不同低共熔溶剂及乙醇溶剂对多酚得率的影响如图1所示。由图1可以看出，8种DES溶剂中，DES-1对多酚的提取效果最佳。可能是由于DES-1与橄榄多酚极性相似利于溶出，而且具有较低的黏性和表面张力，对细胞具有更好的渗透性，故选择氯化胆碱-乙二醇（DES-1）作为低共熔提取溶剂。
图1 DES类型的选择（n=3）
2.2 单因素试验结果
2.2.1 摩尔比对橄榄多酚得率的影响
HBA与HBD之间合适的比值对多酚得率具有很大的影响[29]。由图2可见，氯化胆碱/乙二醇体系的摩尔比从1∶1到1∶4的过程，DES的黏度和表面张力随着降低，橄榄多酚得率逐渐增加，当物质的量比为1∶4时，多酚得率达5.63%，但随着摩尔比的继续变化至1∶5，盐浓度降低，多酚得率反而出现降低趋势。故选择摩尔比1∶4为最佳配比。
图2 摩尔比对多酚得率的影响（n=3）
2.2.2 含水量对橄榄多酚提取率的影响
DES的黏度通常高于常规溶剂的黏度。黏度过高，会导致能量传递缓慢，阻碍多酚从细胞传质到溶剂介质中的效率，添加一定比例的水可以有效改善黏度。因此试验通过混合不同比例水的DES作为提取溶剂，考察含水量对橄榄多酚提取效果的影响。如图3所示，当DES中的含水量从0增加30%时，橄榄多酚得率随含水量的增加而增加，且在含水量为30%时达到最大。而当含水量从30%增加40%时，橄榄多酚得率开始下降，这可能是橄榄多酚和DES之间的氢键相互作用降低。故DES的含水量确定为30%。
图3 含水量对多酚得率的影响（n=3）
2.2.3 液料比对橄榄多酚提取率的影响
原料和溶剂接触面积与液料比有关，这会影响橄榄多酚的提取效果。由图4可知，在液料比为40∶1mL/g之前，提取率随液料比的增大而增大，在40∶1 mL/g时达到最大，但在40∶1 mL/g后得率开始下降。在提取过程中，液料比的提高必然会在较大程度上提高传质推动力，有利于多酚得率的增加[30]。然而，当液料比增加到一定程度后，接触面积达到饱和，再单纯加大溶剂比例对多酚的提取作用不明显，反而使得已吸附的多酚脱附重新回到待提取物中，导致得率出现下降。故液料比选用40∶1 mL/g。
图4 液料比对多酚得率的影响（n=3）
2.2.4 超声时间对橄榄多酚提取率的影响
在一定时间范围内，延长提取时间可以增加多酚的溶出量，但当继续延长时，多酚已基本溶出或溶剂对物料的作用达到某种平衡，并且时间过长会破坏多酚的化学结构，影响多酚的提取效果。如图5所示，随着提取时间的延长，多酚的提取率先上升后下降，多酚提取率30 min时达到最大。随着提取时间的继续延长，多酚的得率反而下降。故最佳提取时间选用30 min。
图5 超声时间对多酚得率的影响（n=3）
2.2.5 超声温度对橄榄多酚提取率的影响
不同超声温度对橄榄多酚提取率的影响如图6所示。研究表明，升高温度降低DES的黏度、增加扩散系数等有利于成分溶出[31]。而且升高温度会加快分子运动，使有效成分加速扩散，但过高温度会加速酚类物质的氧化，不利于提取。当超声温度为40 ℃时，橄榄多酚提取率最高，但温度高于40 ℃提取率呈下降状态。故选择提取温度为40 ℃。
图6 超声温度对多酚得率的影响（n=3）
2.3 响应面设计试验结果
2.3.1 统计分析和模型拟合
单因素试验结果表明，含水量、液料比、超声时间和超声温度对多酚得率有显著影响，故设定为自变量A、B、C、D，橄榄多酚得率为响应值（Y），采用Design-Expert 10.0.3软件设计29组试验。响应面试验设计及结果见表4。通过数据分析得到回归拟合方程：
Y=7.47+0.15A+0.21B+0.13C-0.12D-0.25AB+0.08AC-0.04AD-0.077BC-0.21BD-0.55CD-1.49A2-1.1B2-1.05C2-0.7D2
从表5可知，该回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P=0.105 5＞0.05），说明模型拟合程度好，同时模型回归系数R2=0.984 8，调节后的R2=0.969 6，表明96.96%的数据可用该模型解释，说明回归方程可靠性较高。通过分析方差数据可以看出，一次项含水量、液料比对多酚得率具有极显著影响（P＜0.01），超声温度、超声时间对多酚得率具有显著影响（P＜0.05），各因素的主效应关系为B＞A＞C＞D，即液料比＞含水量＞超声时间＞超声温度。其二次项交互作用AB、CD对多酚得率具有极显著的影响（P＜0.01），BD对多酚得率具有显著的影响（P＜0.05）。
表5 响应面实验方差分析
2.3.2 响应面分析
响应面图和等高线图，可以直观分析各因素对多酚提取率的影响规律和各因素间的交互作用强弱。响应面的曲面陡峭程度与各因素对多酚得率影响显著性呈正相关。A、B、C和D对橄榄多酚得率的影响如图7所示，四个因素之间的交互曲面均具有较大的倾斜度，说明两两因素之间对橄榄多酚得率的影响较大。
图7 各因素交互作用的响应面图
2.3.3 工艺验证与方法比较
根据拟合方程与模型优化提取因素，得到最佳提取条件：含水量30.454%，液料比42.035∶1 mL/g，超声时间25.482 min，超声温度38.616 ℃。为适于实际操作，调整提取工艺参数为含水量30%、液料比42∶1 mL/g、超声时间25 min、超声温度39 ℃。并进行3次平行验证试验，实际橄榄多酚提取率为7.46%±0.06%，与预测值总多酚提取率7.50%在5%偏差范围内，表明该模型可用于橄榄多酚提取。与课题组前期优化的超声辅助乙醇提取橄榄多酚（以53%乙醇为提取溶剂，液料比为32∶1 mL/g、超声提取时间为30min，超声温度为50 ℃）比较，结果显示超声辅助乙醇法提取的多酚得率为7.01%±0.07%。提示超声辅助低共熔溶剂提取橄榄多酚显著提高了橄榄多酚的得率（P＜0.05）。
2.4 橄榄多酚对DPPH清除能力的评价
如图8所示，随着橄榄多酚浓度的增加，清除DPPH自由基的能力增强，DES法提取的橄榄多酚质量浓度从1.48 μg/mL到14.84 μg/mL时，橄榄多酚的清除率从25.20%增加到95.70%，橄榄多酚IC50为3.05 μg/mL，抗坏血酸的IC50为6.47 μg/mL；
而醇提法提取液中橄榄多酚IC50为3.07 μg/mL。结果表明，DES提取的橄榄多酚对DPPH自由基清除能力与醇提法提取的橄榄多酚相当，且清除能力明显高于阳性对照抗坏血酸。提示超声辅助低共熔溶剂法可保持橄榄多酚良好的抗氧化活性。
图8 DPPH清除率测定结果图
利用超声辅助低共熔溶剂对橄榄中多酚成分的提取进行了探索，并对多酚提取液的抗氧化情况进行了考察评价。低共熔溶剂的性能很大程度上是由氢键受体和氢键供体种类决定的。在提取过程中，选择一种合适的DES至关重要。此试验以氯化胆碱为氢键受体，以醇、酸、脲、乙酰胺为氢键供体，通过预试验筛选了不同的低共熔溶剂组合，制备了8种不同体系的DES。验试结果表明，8种DES中，由氯化胆碱-乙二醇（摩尔比1∶4）构成的DES更适合于橄榄多酚的提取。经响应面设计试验优化，橄榄多酚的最佳提取工艺：采用含水量为30%的氯化胆碱-乙二醇（摩尔比1∶4）为提取溶剂、液料比为42∶1 mL/g、超声时间为25 min、超声温度为39 ℃。在此条件下，橄榄多酚得率为7.46%±0.06%，显著高于橄榄多酚得率为7.01%±0.07%的超声辅助乙醇法。
通过DPPH清除试验，以抗坏血酸为参照，在橄榄多酚质量浓度为14.84 μg/mL时，清除DPPH的抑制率高达95.70%。DES提取的橄榄多酚清除DPPH的半数抑制浓度（IC50）为3.05 μg/mL，醇提法提取的橄榄多酚为3.07 μg/mL，抗坏血酸为6.45 μg/mL。两种提取法的橄榄多酚抗氧化活性相当，且明显高于抗坏血酸。可见采用超声辅助低共熔溶剂法提取橄榄多酚不仅提取效率高，而且可保持橄榄多酚良好的抗氧化活性。
综上，超声辅助低共熔溶剂法提取橄榄多酚绿色环保、简单易行、提取率高，且提取的橄榄多酚具有良好的抗氧化活性，可作为药食同源橄榄中橄榄多酚提取的新方法，为橄榄资源的充分开发利用奠定了试验基础。
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